發(fā)布時(shí)間：2020-11-17 10:38

　　 擬核相關(guān)蛋白又稱擬核結(jié)構(gòu)蛋白、細(xì)菌染色質(zhì)蛋白或DNA結(jié)合蛋白。擬核相關(guān)蛋白通過與DNA結(jié)合并使DNA彎折、橋連、或纏繞,在擬核結(jié)構(gòu)的壓縮和組織中起到了重要的作用,并影響著細(xì)菌染色體的復(fù)制,分離,修復(fù)和表達(dá)過程。結(jié)核分枝桿菌是導(dǎo)致結(jié)核病的致病菌,而恥垢分枝桿菌是實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)核病常用的模式菌。分枝桿菌主要編碼三種染色質(zhì)蛋白,即mHU、Lsr2和整合宿主因子(mIHF),mIHF僅在放線菌中保守,但與其他細(xì)菌擬核相關(guān)蛋白的相似性很低。目前已經(jīng)有報(bào)道證明mIHF對(duì)分枝桿菌的生存是必須的。經(jīng)過序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)來自結(jié)核分枝桿菌的MtIHF和恥垢分枝桿菌的MsIHF同源性很高,C端序列的一致性接近100%,而生化實(shí)驗(yàn)表明去除N端后對(duì)蛋白功能沒有影響。因此對(duì)MsIHF的研究有助于結(jié)核病新藥的研發(fā)。在本研究中,我們構(gòu)建了含有MsIHF目的基因的pET28at-plus質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入E.coli表達(dá)菌株RosettaⅡ中,誘導(dǎo)MsIHF的大量表達(dá),高壓破碎細(xì)胞后,通過Ni柱親和層析、離子交換層析、分子凝膠過濾層析的方法對(duì)蛋白進(jìn)行純化,得到純度約95%以上的目的蛋白后進(jìn)行晶體的初篩。設(shè)計(jì)合適的DNA長(zhǎng)度與純化好的蛋白進(jìn)行孵育從而得到MsIHF-DNA復(fù)合物,對(duì)復(fù)合物初篩出晶體后通過調(diào)整沉淀劑濃度、pH、蛋白濃度、DNA長(zhǎng)度以及種晶的方法進(jìn)行晶體的優(yōu)化,直到獲得分辨率高的晶體,通過X-射線衍射進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集。我們解析了MsIHF與16 bpDNA的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu):在一個(gè)不對(duì)稱單元中,兩個(gè)MsIHF單體形成了一個(gè)二體,并結(jié)合了一條DNA雙鏈。這兩個(gè)MsIHF單體的結(jié)構(gòu)幾乎完全相同,都由五個(gè)α-螺旋組成。在MsIHF蛋白質(zhì)二聚體的兩側(cè)形成了較大的正電區(qū)域。不同于大腸桿菌中的異源二聚體IHF,可以誘導(dǎo)DNA形成一個(gè)U型彎折,而MsIHF僅僅使DNA的構(gòu)象發(fā)生了輕微的改變。單個(gè)氨基酸的突變和MsIHF-DNA相互作用分析證明兩個(gè)正電荷表面都可以結(jié)合DNA,這表明了MsIHF可以橋連不同的DNA分子,或者穩(wěn)定DNA的彎折。我們通過分析超速離心實(shí)驗(yàn)、化學(xué)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)證明了MsIHF在溶液中以二聚體形式存在,與解析的結(jié)構(gòu)信息一致。MsIHF在放線菌中具有高度的保守性,揭示放線菌中的IHF通過一個(gè)新的DNA相互作用機(jī)制發(fā)揮其功能,為mIHF作為結(jié)核病藥物設(shè)計(jì)的潛在靶標(biāo)提供一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R378.911
【部分圖文】：

著細(xì)菌中這些蛋白被揭示出越來越明確的屬性后，這個(gè)命名就顯得不太。它們現(xiàn)在統(tǒng)稱為擬核相關(guān)蛋白（ＮＡＰｓ），可以在沒有暗示它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上與有任何相似性的情況下，更精確的反映它們?cè)诩?xì)胞中的位置。??擬核相關(guān)蛋白（ＮＡＰｓ）是一類小的，能夠大量表達(dá)的蛋白，通過與ＤＮＡ使ＤＮＡ彎折、橋連、或纏繞，從而在細(xì)菌染色體的組織，分離，復(fù)制，過程中都起到了重要作用。一些擬核相關(guān)蛋白能夠在特定啟動(dòng)子處調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)始，并且與轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方式相一致，細(xì)菌生長(zhǎng)階段不同蛋白的表達(dá)量和功能都有一定的影響。某些蛋白在指數(shù)生長(zhǎng)期是不存在的，穩(wěn)定期是大量存在的，反過來也一樣［３，４］。在轉(zhuǎn)錄過程中，由于一些ＮＡＰｓ了全局性的調(diào)控作用，缺失后可能會(huì)導(dǎo)致多效性的表型變化［５—７］。??目前在大腸桿菌中至少有１２種不同的擬核相關(guān)蛋白被鑒定出來，其中ＩＨＦ，Ｈ－ＮＳ以及Ｆｉｓ被研究的最為透徹［５，６，８］。如下圖所示，大腸桿菌幾種擬蛋白通過橋連、纏繞和彎折等不同的方式在染色體組織中起到了重要的作

＞?ｓ?＾??圖１．２幾種擬核相關(guān)蛋白對(duì)ＤＮＡ進(jìn)行橋連、纏繞和彎折Ｍ??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｎｕｃｌｅｏｉｄ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｗｉｔｈ?ＤＮＡ?ｂｒｉｄｇｉｎｇ，?ｗｒａｐｐｉｎｇ?ｏｒ?ｂｅｎｄｉｎｇ??２??

它作為擬核相關(guān)蛋白在細(xì)菌的ＤＮＡ壓縮以及作用。它可以與很多靶標(biāo)ＤＮＡ結(jié)合，并且以在大腸桿菌中轉(zhuǎn)錄因子一樣而被熟知［２９］。它主要的功能是使靶標(biāo)ＤＮＡ彎ＡＰｓ和轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用＠１。??一個(gè)小的，熱穩(wěn)定的蛋白，能夠結(jié)合位于富含ＡＴ的核心保守序聚體有功能活性的的亞基包括ＩＨＦａ?（１１．１Ｋ）和ＩＨＦＰ?（１０．７Ｋ基因所編碼，分別是和／Ａ／Ｓ［２７Ｉ。與ＨＵ蛋白的結(jié)構(gòu)具有較體都是由三個(gè)ａ螺旋形成中心體，兩個(gè)反向平行的ｐ帶形成兩的尖端都含有一個(gè)可以插入ＤＮＡ堿基之間的脯氨酸（黃色），的堆積作用，導(dǎo)致ＤＮＡ小溝擴(kuò)大，形成劇烈的扭結(jié)，發(fā)生Ｕ染色體上已經(jīng)鑒定出大約１０００個(gè)左右特異的ＩＨＦ結(jié)合位點(diǎn)。動(dòng)子附近并且可能參與轉(zhuǎn)錄激活［３３，３４］。??
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本文編號(hào)：2887404