[背景和目的]肝臟移植已成為終末期肝病的主要治療方式,但移植肝膽道缺血再灌注損傷引起的膽道并發(fā)癥是影響肝移植遠(yuǎn)期療效的主要原因之一。因此,減輕移植肝膽道缺血再灌注損傷是目前改善移植受者預(yù)后和存活率的首要策略。HO-1是血紅素代謝的限速酶,有高度的可誘導(dǎo)性,具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和調(diào)節(jié)微循環(huán)的功能,但誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)是否可以減輕移植肝膽道缺血再灌注損傷,且肝移植是將供體肝臟移植給受體,應(yīng)該先處理供體還是受體才能發(fā)揮更大的保護(hù)作用仍不清楚。本研究擬通過(guò)建立大鼠原位肝移植冷缺血再灌注損傷模型,構(gòu)建大鼠H0-1過(guò)表達(dá)腺病毒載體和借助RNAi技術(shù)構(gòu)建靶向HO-1-shRNA腺病毒載體,轉(zhuǎn)入大鼠活體內(nèi)誘導(dǎo)或沉默HO-1基因的表達(dá),觀察HO-1對(duì)移植肝膽汁分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響,同時(shí)分析HO-1與膽管上皮細(xì)胞損害、膽管炎發(fā)生及膽管上皮周圍纖維化進(jìn)程的內(nèi)在關(guān)系,并通過(guò)改變供體和(或)受體HO-1表達(dá)來(lái)觀察其對(duì)膽道缺血再灌注損傷的影響,為臨床上改善肝移植術(shù)后缺血型膽道病變提供新的思路和方法。[方法]1.構(gòu)建大鼠Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,并分別轉(zhuǎn)入大鼠體內(nèi),24h后取出肝臟,利用Westem-blot檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá)水平,觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。2.大鼠原位肝移植模型的建立:根據(jù)Kamada的“二袖套法”,建立大鼠原位肝移植模型,觀察術(shù)中、術(shù)后并發(fā)癥及術(shù)畢24h后存活率,并取3只作為手術(shù)組與正常組大鼠比較光鏡下肝臟組織形態(tài)學(xué)變化,證實(shí)大鼠肝移植缺血再灌注模型建立成功。3.大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究:將320只SD大鼠按供、受體隨機(jī)選取分為5組(每組供、受體各32只),分別為A組(空白腺病毒)、B組(供體注射Adv-HO-1,受體注射空白腺病毒)、C組(供、受體均注射Adv-HO-1)、D組(供體注射Adv-HO-1-siRNA,受體注射空白腺病毒)和E組(供、受體均注射Adv-HO-1-siRNA)。各組于術(shù)前24h尾靜脈分別注射空白腺病毒、Adv-HO-1、Adv-HO-1-siRNA各lml,濃度均為3×108pfu/ml。肝移植后收集lh內(nèi)膽汁檢測(cè)其成分,分別于術(shù)后1d、3d、7d、14d處死受體,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功酶學(xué)(ALT、AST、ALP、GGT、TBIL),免疫組化檢測(cè) CD3+、CD45R+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)程度和ki67標(biāo)記膽管上皮細(xì)胞增殖情況,光鏡和透射電鏡下觀察肝臟及膽管組織形態(tài)學(xué)變化,激光共聚焦雙重免疫熒光標(biāo)記Laminine和CK-18,觀察大、小膽管基底膜的破壞程度和連續(xù)性,檢測(cè)膽汁成分并用Western-blot 分析 HO-1、Bsep、Mrp2、Ntcp 的蛋白含量。[結(jié)果]1.腺病毒轉(zhuǎn)染效果檢測(cè):成功構(gòu)建Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,經(jīng)測(cè)序證明擴(kuò)增序列正確,轉(zhuǎn)染大鼠體內(nèi)顯示:與空病毒組相比,誘導(dǎo)組HO—1的蛋白表達(dá)水平上調(diào),抑制組HO—1的蛋白表達(dá)水平下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.模型建立結(jié)果:一共行大鼠原位肝移植175例,肝移植術(shù)中各種原因死亡者及術(shù)后24h內(nèi)死亡者共計(jì)12例,以術(shù)后存活24h視為手術(shù)成功,手術(shù)成功163例。各組之間死亡例數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),24h后存活率約為93%(163/175)。光鏡下觀察手術(shù)組與正常組大鼠組織形態(tài)學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)手術(shù)組組織形態(tài)學(xué)變化符合缺血再灌注損傷,證明模型建立成功。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①肝功酶學(xué):再灌注后1d、3d、7d和14d,與A組比較,B、C 組 ALT、AST、GGT、ALP、TBIL 明顯下降,D、E組 ALT、AST、GGT、ALP、TBIL明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);②免疫組化檢測(cè):再灌注后ld,E組CD3+、CD45R+T淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞在匯管區(qū)浸潤(rùn)較A組增多,C組的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較A組減少;7d時(shí)E組ki67抗體標(biāo)記膽管上皮細(xì)胞壞死、脫落、增殖較明顯,C組ki67抗體標(biāo)記膽管上皮細(xì)胞壞死、增殖不明顯,膽管反應(yīng)輕;③光鏡下病理組織學(xué)變化:A組、B組和C組肝細(xì)胞變性、水腫,有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);D組和E組肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂,肝細(xì)胞變性、壞死、增生,匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);④透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu):與A組相比,B組、C組膽管上皮細(xì)胞損傷較輕,線粒體不腫脹,微絨毛豐富,排列整齊,D組和E組可見(jiàn)膽管柱狀上皮細(xì)胞明顯腫脹變形,甚至導(dǎo)致膽管閉塞,膽管內(nèi)微絨毛消失,線粒體空泡化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張;⑤激光共聚焦雙重免疫熒光檢測(cè):B、C組膽管損傷較輕,而D、E組可見(jiàn)膽管基底膜部分脫落,膽管損傷較重,周圍肝細(xì)胞明顯變性;⑥Western-blot檢測(cè):B組和C組HO—1、Mrp2、Bsep、Ntcp蛋白水平較A組、D組和E組升高更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。[結(jié)論]1.構(gòu)建了大鼠Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,并成功轉(zhuǎn)染至大鼠體內(nèi)。2.成功建立“二袖套”法大鼠原位肝移植模型,并采用“支架法”重建肝動(dòng)脈,使其更符合臨床上肝移植的病理生理改變,保證了較高的移植大鼠術(shù)后存活率,證明我們所建立的大鼠原位肝移植模型是一種穩(wěn)定、便于操作的模型,值得推廣。3.在肝移植術(shù)前誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)HO-1高表達(dá),能明顯減輕移植肝膽道缺血再灌注損傷,抑制HO-1的表達(dá)則會(huì)加重其損傷。4.優(yōu)先處理供體,誘導(dǎo)供體HO-1的高表達(dá)比誘導(dǎo)受體HO-1的高表達(dá)對(duì)減輕移植肝膽道缺血再灌注損傷的作用更明顯,為臨床上減輕和防治肝移植術(shù)后缺血型膽道病變提供新的思路和方法。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R657.3;R-332
【部分圖文】：

圖２?Ｎｏｒｗａｙ大鼠與ＳＤ大鼠序列對(duì)比??Ｆｉｇ２．Ｃｏｍｐａｒｅｄ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｒａｔｔｕｓ?ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ?ＨＯ－１?ＣＤＳ?ａｎｄ?ｒａｔｔｕｓ?ＳＤ?ＨＯ－１?ＣＤＳ??３．?ｆｆｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鑒定Ａｄｖ—ｐＣＷ３１８在大鼠肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)??大鼠Ｈ０—１?—抗采用１?：?５００稀釋倍數(shù)（圖３）。Ａｄｖ－ｐＣＷ３１８原倍及稀釋倍??數(shù)為１ＣＴ１倍經(jīng)Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測(cè)在３２ＫＤ附近處有特征條帶，其大小和目的基??因融合蛋白相吻合，表明大鼠ＨＯ—１基因過(guò)表達(dá)腺病毒載體Ａｄｖ－ＨＯ－ｌ構(gòu)建成功。??ＡＤＶ－ｆＨＭＯＸ１?２００?２０?〇??４３ｋ〇??ＨＭＯＸｌ＾?３２ｋＤ??

Ｆｉｇ２．Ｃｏｍｐａｒｅｄ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｒａｔｔｕｓ?ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ?ＨＯ－１?ＣＤＳ?ａｎｄ?ｒａｔｔｕｓ?ＳＤ?ＨＯ－１?ＣＤＳ??３．?ｆｆｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鑒定Ａｄｖ—ｐＣＷ３１８在大鼠肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)??大鼠Ｈ０—１?—抗采用１?：?５００稀釋倍數(shù)（圖３）。Ａｄｖ－ｐＣＷ３１８原倍及稀釋倍??數(shù)為１ＣＴ１倍經(jīng)Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測(cè)在３２ＫＤ附近處有特征條帶，其大小和目的基??因融合蛋白相吻合，表明大鼠ＨＯ—１基因過(guò)表達(dá)腺病毒載體Ａｄｖ－ＨＯ－ｌ構(gòu)建成功。??ＡＤＶ－ｆＨＭＯＸ１?２００?２０?〇??４３ｋ〇??ＨＭＯＸｌ＾?３２ｋＤ??圖３?Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測(cè)Ｈ０＿１蛋白表達(dá)水平??Ｆｉｇ３．Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌｓ?ｏｆ?ＨＯ－１?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ?ｂｙ?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ??４．

Ｆｉｇ４．?ＢａｍＨ?Ｉ?／Ｎｓｉ?Ｉ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐＬＫＯ．?１?ａｎｄ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??注：ｌ為ｐＬＫ０．１質(zhì)粒，雙酶切后大小為?６３７１ｂｐ，２為ＰＣＲ產(chǎn)物，雙酶切后大小為?７３９?ｂｐ??連接產(chǎn)物ｐＬＫＯ．ｌ?—?ＥＧＦＰ瓊脂糖凝膠電泳大小為７０００?ｂｐ?（圖５）。??■＝??圖５．?ｐＬＫＯ．ｌ?—ＥＧＦＰ提取質(zhì)粒后電泳??Ｆｉｇ５．?Ａｆｔｅｒ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ??轉(zhuǎn)染２９３細(xì)胞功能驗(yàn)證，有綠色熒光（圖６）。??３１??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2887281