[背景和目的]肝臟移植已成為終末期肝病的主要治療方式,但移植肝膽道缺血再灌注損傷引起的膽道并發(fā)癥是影響肝移植遠期療效的主要原因之一。因此,減輕移植肝膽道缺血再灌注損傷是目前改善移植受者預后和存活率的首要策略。HO-1是血紅素代謝的限速酶,有高度的可誘導性,具有抗氧化、抗炎、調節(jié)細胞周期和調節(jié)微循環(huán)的功能,但誘導HO-1的表達是否可以減輕移植肝膽道缺血再灌注損傷,且肝移植是將供體肝臟移植給受體,應該先處理供體還是受體才能發(fā)揮更大的保護作用仍不清楚。本研究擬通過建立大鼠原位肝移植冷缺血再灌注損傷模型,構建大鼠H0-1過表達腺病毒載體和借助RNAi技術構建靶向HO-1-shRNA腺病毒載體,轉入大鼠活體內誘導或沉默HO-1基因的表達,觀察HO-1對移植肝膽汁分泌、轉運能力的影響,同時分析HO-1與膽管上皮細胞損害、膽管炎發(fā)生及膽管上皮周圍纖維化進程的內在關系,并通過改變供體和(或)受體HO-1表達來觀察其對膽道缺血再灌注損傷的影響,為臨床上改善肝移植術后缺血型膽道病變提供新的思路和方法。[方法]1.構建大鼠Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,并分別轉入大鼠體內,24h后取出肝臟,利用Westem-blot檢測HO-1蛋白表達水平,觀察體內轉染效果。2.大鼠原位肝移植模型的建立:根據(jù)Kamada的“二袖套法”,建立大鼠原位肝移植模型,觀察術中、術后并發(fā)癥及術畢24h后存活率,并取3只作為手術組與正常組大鼠比較光鏡下肝臟組織形態(tài)學變化,證實大鼠肝移植缺血再灌注模型建立成功。3.大鼠體內實驗研究:將320只SD大鼠按供、受體隨機選取分為5組(每組供、受體各32只),分別為A組(空白腺病毒)、B組(供體注射Adv-HO-1,受體注射空白腺病毒)、C組(供、受體均注射Adv-HO-1)、D組(供體注射Adv-HO-1-siRNA,受體注射空白腺病毒)和E組(供、受體均注射Adv-HO-1-siRNA)。各組于術前24h尾靜脈分別注射空白腺病毒、Adv-HO-1、Adv-HO-1-siRNA各lml,濃度均為3×108pfu/ml。肝移植后收集lh內膽汁檢測其成分,分別于術后1d、3d、7d、14d處死受體,全自動生化分析儀檢測肝功酶學(ALT、AST、ALP、GGT、TBIL),免疫組化檢測 CD3+、CD45R+T淋巴細胞的浸潤程度和ki67標記膽管上皮細胞增殖情況,光鏡和透射電鏡下觀察肝臟及膽管組織形態(tài)學變化,激光共聚焦雙重免疫熒光標記Laminine和CK-18,觀察大、小膽管基底膜的破壞程度和連續(xù)性,檢測膽汁成分并用Western-blot 分析 HO-1、Bsep、Mrp2、Ntcp 的蛋白含量。[結果]1.腺病毒轉染效果檢測:成功構建Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,經測序證明擴增序列正確,轉染大鼠體內顯示:與空病毒組相比,誘導組HO—1的蛋白表達水平上調,抑制組HO—1的蛋白表達水平下降,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.模型建立結果:一共行大鼠原位肝移植175例,肝移植術中各種原因死亡者及術后24h內死亡者共計12例,以術后存活24h視為手術成功,手術成功163例。各組之間死亡例數(shù)無統(tǒng)計學差異(p0.05),24h后存活率約為93%(163/175)。光鏡下觀察手術組與正常組大鼠組織形態(tài)學變化,發(fā)現(xiàn)手術組組織形態(tài)學變化符合缺血再灌注損傷,證明模型建立成功。3.體內實驗結果:①肝功酶學:再灌注后1d、3d、7d和14d,與A組比較,B、C 組 ALT、AST、GGT、ALP、TBIL 明顯下降,D、E組 ALT、AST、GGT、ALP、TBIL明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);②免疫組化檢測:再灌注后ld,E組CD3+、CD45R+T淋巴細胞等炎性細胞在匯管區(qū)浸潤較A組增多,C組的炎性細胞浸潤較A組減少;7d時E組ki67抗體標記膽管上皮細胞壞死、脫落、增殖較明顯,C組ki67抗體標記膽管上皮細胞壞死、增殖不明顯,膽管反應輕;③光鏡下病理組織學變化:A組、B組和C組肝細胞變性、水腫,有炎性細胞浸潤;D組和E組肝小葉結構明顯紊亂,肝細胞變性、壞死、增生,匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤;④透射電鏡觀察超微結構:與A組相比,B組、C組膽管上皮細胞損傷較輕,線粒體不腫脹,微絨毛豐富,排列整齊,D組和E組可見膽管柱狀上皮細胞明顯腫脹變形,甚至導致膽管閉塞,膽管內微絨毛消失,線粒體空泡化,內質網(wǎng)擴張;⑤激光共聚焦雙重免疫熒光檢測:B、C組膽管損傷較輕,而D、E組可見膽管基底膜部分脫落,膽管損傷較重,周圍肝細胞明顯變性;⑥Western-blot檢測:B組和C組HO—1、Mrp2、Bsep、Ntcp蛋白水平較A組、D組和E組升高更明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。[結論]1.構建了大鼠Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,并成功轉染至大鼠體內。2.成功建立“二袖套”法大鼠原位肝移植模型,并采用“支架法”重建肝動脈,使其更符合臨床上肝移植的病理生理改變,保證了較高的移植大鼠術后存活率,證明我們所建立的大鼠原位肝移植模型是一種穩(wěn)定、便于操作的模型,值得推廣。3.在肝移植術前誘導大鼠體內HO-1高表達,能明顯減輕移植肝膽道缺血再灌注損傷,抑制HO-1的表達則會加重其損傷。4.優(yōu)先處理供體,誘導供體HO-1的高表達比誘導受體HO-1的高表達對減輕移植肝膽道缺血再灌注損傷的作用更明顯,為臨床上減輕和防治肝移植術后缺血型膽道病變提供新的思路和方法。
【學位單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R657.3;R-332
【部分圖文】：

圖２?Ｎｏｒｗａｙ大鼠與ＳＤ大鼠序列對比??Ｆｉｇ２．Ｃｏｍｐａｒｅｄ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｒａｔｔｕｓ?ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ?ＨＯ－１?ＣＤＳ?ａｎｄ?ｒａｔｔｕｓ?ＳＤ?ＨＯ－１?ＣＤＳ??３．?ｆｆｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鑒定Ａｄｖ—ｐＣＷ３１８在大鼠肝細胞內的表達??大鼠Ｈ０—１?—抗采用１?：?５００稀釋倍數(shù)（圖３）。Ａｄｖ－ｐＣＷ３１８原倍及稀釋倍??數(shù)為１ＣＴ１倍經Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測在３２ＫＤ附近處有特征條帶，其大小和目的基??因融合蛋白相吻合，表明大鼠ＨＯ—１基因過表達腺病毒載體Ａｄｖ－ＨＯ－ｌ構建成功。??ＡＤＶ－ｆＨＭＯＸ１?２００?２０?〇??４３ｋ〇??ＨＭＯＸｌ＾?３２ｋＤ??

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Ｆｉｇ４．?ＢａｍＨ?Ｉ?／Ｎｓｉ?Ｉ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐＬＫＯ．?１?ａｎｄ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??注：ｌ為ｐＬＫ０．１質粒，雙酶切后大小為?６３７１ｂｐ，２為ＰＣＲ產物，雙酶切后大小為?７３９?ｂｐ??連接產物ｐＬＫＯ．ｌ?—?ＥＧＦＰ瓊脂糖凝膠電泳大小為７０００?ｂｐ?（圖５）。??■＝??圖５．?ｐＬＫＯ．ｌ?—ＥＧＦＰ提取質粒后電泳??Ｆｉｇ５．?Ａｆｔｅｒ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ??轉染２９３細胞功能驗證，有綠色熒光（圖６）。??３１??
【參考文獻】

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本文編號：2887281