[目的]本研究首先分析寨卡病毒亞洲型和非洲型基因組核苷酸序列同源性及結(jié)構(gòu)蛋白C、prM核苷酸和氨基酸序列差異,以登革的毒力位點(diǎn)作為寨卡的參考,探究Ⅲ型登革病毒在C6/36和Vero細(xì)胞中復(fù)制對其毒力的影響,在病毒毒力與位點(diǎn)突變有相關(guān)性的基礎(chǔ)上,利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建寨卡病毒突變株并進(jìn)行寨卡減毒株的初步篩選。[方法]分別選擇五個不同的寨卡病毒亞洲型和非洲型全長基因組序列,并獲得它們相應(yīng)的氨基酸序列,采用BIOEDIT軟件進(jìn)行比對,分析相似度,統(tǒng)計(jì)不同型別間結(jié)構(gòu)蛋白C、prM的核苷酸突變和氨基酸替代位點(diǎn);將兩株Ⅲ型登革病毒在C6/36細(xì)胞上接種傳代培養(yǎng),待其毒力穩(wěn)定再接種到Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng),用Ⅲ型登革標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒檢測不同代次病毒拷貝數(shù),并通過RCR擴(kuò)增全長獲得全長序列,與原代病毒序列比對;將寨卡全長克隆質(zhì)粒進(jìn)行分析,并結(jié)合登革的毒力位點(diǎn),確定寨卡基因組上可操作的毒力位點(diǎn),利用定點(diǎn)突變的方式將寨卡全長克隆質(zhì)粒上的毒力位點(diǎn)突變,得到突變質(zhì)粒,將改造后的骨架進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞拯救病毒,拯救出來的病毒利用RT-PCR、免疫熒光鑒定、拯救病毒增殖特性分析、蝕斑實(shí)驗(yàn)、成鼠乳鼠接種實(shí)驗(yàn)鑒定其生物學(xué)特征。[結(jié)果]寨卡病毒亞洲型和非洲型的核酸相似性在88.00%-89.00%之間,不同型別的結(jié)構(gòu)蛋白C和prM堿基的突變比較顯示C基因一共有19個堿基突變,prM基因一共有48個堿基突變,氨基酸翻譯比對顯示這67個堿基突變均為有效突變。優(yōu)選出一株Ⅲ型登革病毒在C6/36上毒力增強(qiáng)(P17-C6/36),后在Vero細(xì)胞上毒力減弱(P10-Vero),全基因分析PO、P17-C6/36、P10-Vero發(fā)現(xiàn)全長堿基共有16處發(fā)生突變,導(dǎo)致了 12個氨基酸的非同義突變。其中,堿基第5826位點(diǎn)、第6251位點(diǎn)、第7907位點(diǎn)均表現(xiàn)為P0和P10-Vero堿基相同,而P17-C6/36堿基發(fā)生突變,且對應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)第1942位點(diǎn)、第2084位點(diǎn)、第2636位點(diǎn)均發(fā)生非同義突變,寨卡毒力位點(diǎn)分析顯示可進(jìn)行一個減毒位點(diǎn)的突變和四個增毒位點(diǎn)的突變,成功構(gòu)建并拯救寨卡突變病毒 Pzika-FL-G53D、Pzika-FL-T47S、Pzika-FL-S64T、Pzika-FL-V255A、Pzika-FL-S260T,并初步表明 Pzikv-FL-G53D 較 Pzikv-FL 在細(xì)胞水平上有一定的減毒效果,通過兩日齡乳鼠寨卡注射實(shí)驗(yàn)顯示Pzikv-FL-G53D較Pzikv-FL具有更低的神經(jīng)毒力。[結(jié)論]單位點(diǎn)的突變可能對病毒株的致病性、感染性等造成影響,傳代細(xì)胞更換對登革病毒的毒力造成影響,多次傳代及更換細(xì)胞傳代后仍可能發(fā)生回復(fù)突變。本研究為研究寨卡病毒生物學(xué)和致病性差異提供參考,為后續(xù)寨卡病毒減毒策略的研究提供了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R373
【部分圖文】：

得樣品Ｃｔ值、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程ｙ＝＿０．２３８１ｘ＋１０．６５２，計(jì)算得到樣品的拷??貝濃度（病毒拷貝數(shù)／ｕｌ上清）（表３），并繪制ＰＯ、Ｐ１７－Ｃ６／３６、Ｐ１０－Ｖｅｒｏ病毒載量??圖（見圖５），由圖可知，ＩＩＩ型登革病毒ＤＶ３－１在Ｐ１７－Ｃ６／３６時有著較高的病毒拷貝??數(shù)，而在Ｐ０及ＰｌＯ－Ｖｅｒｏ時病毒拷貝數(shù)偏低。??１０．００??＾?８．００??＾?６．。。??－?４．０。??￡?ｙ?＝?－０．２３８１ｘ＋?１０．６５２??２．００?Ｒ：?＝?０．９９８５??０．００??０?１０?２０?３０?４０??（－＇Ｔ?位??圖４?ｉｎ型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線??Ｆｉｇｕｒｅ?４．?Ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｔｙｐｅ?Ｕｌｄｅｎｇｕｅ?ｖｉｒｕｓ?ｓｔａｎｄａｒｄ??１８??

３．２寨卡病毒突變株的構(gòu)建??通過兩段法擴(kuò)增，每個突變點(diǎn)的ＡＢ段均被有效地?cái)U(kuò)增出，均在７０００ｂｐ左右，??如下（圖９）所示，產(chǎn)物去除甲基化模板質(zhì)粒后，測得濃度和純度分別如下：Ｇ５３Ｄ－１??濃度?６９．０ｎｇ／ｕｌ，純度?０Ｄ２６０／ＯＤ２８０＝１．８２；?Ｇ５３Ｄ－２?濃度?５４．４ｎｇ／ｕｌ，純度?１．７５；?Ｔ４７Ｓ－１??濃度?１４６．２ｎｇ／ｕｌ，純度?１．８１；?Ｔ４７Ｓ－２?濃度?６７．７ｎｇ／ｕｌ，純度?１．８３；?Ｓ６４Ｔ－１?濃度?８１．４ｎｇ／ｕｌ，??純度?１．７４；?Ｓ６４Ｔ－２?濃度?８７．６ｎｇ／ｕｌ，純度?１．７７；?Ｖ２５５Ａ－１?濃度?３３．７ｎｇ／ｕｌ，純度?１．８３；??Ｖ２５５Ａ－２?濃度?５７．７ｎｇ／ｕｌ，純度?１．８２；?Ｓ２６０Ｔ－１?濃度?１０７．６ｎｇ／ｕｌ，純度?１．８４；?Ｓ２６０Ｔ－２??濃度２３．７ｎｇ／ｕｌ，純度１．９，各回收產(chǎn)物均滿足下一步驟連接的純度和濃度，連接轉(zhuǎn)??化平板均有單克隆長出，表現(xiàn)為Ｇ５３Ｄ長出一個單克��；Ｔ４７Ｓ長出２個單克隆；??Ｓ６４Ｔ長出５個單克��；Ｖ２５５Ａ長出２３個單克��；Ｓ２６０Ｔ長出２７個單克隆，將各??突變點(diǎn)單克隆擴(kuò)増小提質(zhì)粒

各重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ｃｌａ?Ｉ、Ｎｏｔ?Ｉ雙酶切后，用６＞＜Ｌｏａｄｉｎｇ?Ｂｕｆｆｅｒ終止??反應(yīng)，�。保埃酰烀盖挟a(chǎn)物上樣電泳（ｌ％Ａｇａｒｏｓｅ），用凝膠成像儀成像均得到１０８０８ｂｐ??的片段和３４６６ｂｐ的片段，如下圖１０所示，與預(yù)期相符。??Ｍｌ?質(zhì)Ｔ４７ＳＴ４７Ｓ?Ｓ６４Ｔ?Ｖ２５５ＡＳ２６０Ｔ??ＩＩ??．１１??Ｍｌ．?ＤＬ２００００?Ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ２．?ＤＬ１００００?Ｍａｒｋｅｒ；??質(zhì)Ｔ４７Ｓ：突變質(zhì)粒Ｔ４７Ｓ??圖１０酶切鑒定突變株??Ｆｉｇ?１０．?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍｕｔａｎｔｓ?ｂｙ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??３．３．２測序鑒定??將測序結(jié)果進(jìn)行拼接，各突變重組質(zhì)粒與原質(zhì)粒進(jìn)行序列比對，如圖１１所示，??成功將ＦＳＳ１３０２５上ＮＳ１第５３個氨基酸由甘氨酸（ＧＧＧ）突變?yōu)樘於彼幔ǎ牵粒茫??成功將ＦＳＳ１３０２５?Ｅ第４７個氨基酸由蘇氨酸（ＡＣＡ）突變?yōu)榻z氨酸（ＴＣＡ）；成功將??ＦＳＳ１３０２５Ｅ第６４個氨基酸由絲氨酸（ＴＣＡ）突變?yōu)樘K氨酸（ＡＣＡ）；成功將ＦＳＳ１３０２５??Ｅ第２５５個氨基酸由纈氨酸（ＧＴＣ）突變?yōu)楸彼幔ǎ牵茫茫�；成功將ＦＳＳ１３０２�?Ｅ第??２６０個氨基酸由絲氨酸（ＡＧＴ）突變?yōu)樘K氨酸（ＡＣＴ）
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本文編號：2884635