SET domain containing 2(Setd 2)基因編碼合成組蛋白H3K36甲基轉(zhuǎn)移酶,其功能缺失性突變與白血病、淋巴瘤等血液系統(tǒng)疾病均相關(guān)。Setd2在胚胎發(fā)育中具有重要作用,但其在造血系統(tǒng)中的作用仍不明確。因此,我們利用Cre-LoxP系統(tǒng),通過敲除Setd2基因第6外顯子構(gòu)建了血液系統(tǒng)條件性敲除的小鼠模型,并利用該模型闡述了Setd 對維持正常成年造血干細胞具有重要的作用。Setd2敲除小鼠表現(xiàn)有白細胞減少、巨細胞性貧血、血小板增高,同時伴有骨髓有核細胞減少、紅系病態(tài)造血,以及骨髓低級別纖維化。Setd2敲除小鼠骨髓造血干細胞及除紅系以外的造血祖細胞數(shù)量均較對照組顯著減少,同時伴有紅系、巨核系、淋巴系的分化異常。除了數(shù)量上的異常,Setd2敲除的小鼠干細胞在移植后在受體內(nèi)不能重建骨髓,相關(guān)功能實驗結(jié)果表明其不能維持正常靜息狀態(tài),凋亡增多,多能分化潛能減低。同時生物信息相關(guān)分析也表明了Setd2敲除后,造血干細胞內(nèi)分化相關(guān)信號通路顯著上調(diào),造血干細胞不能維持正常的靜息狀態(tài)進而進入細胞周期走向分化,最終導致了干細胞衰竭。分子機制上,我們認為正常Setd2在小鼠造血干細胞中抑制了Nsd1/2/3相關(guān)轉(zhuǎn)錄復合物,Nsd1/2/3可以招募轉(zhuǎn)錄延長復合物(SEC)/Dotll并且調(diào)控RNA多聚酶Ⅱ的相關(guān)功能,從而調(diào)控了包括Myc在內(nèi)的一群對干細胞具有重要作用的基因。當運用SEC/Dot1l相關(guān)組分抑制劑時,Setd2敲除干組細胞的功能異常及Myc等蛋白表達水平的異常均可被部分挽救。本研究揭示了 H3K36組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Setd2通過限制NSDs/SEC介導的RNA多聚酶Ⅱ的延長從而維持了成年造血干細胞的正常功能。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

浙江大學博士學位論文?正文第－部分材料與方法??１．２．４實驗方法??１．２．４．１?ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９?構(gòu)建小鼠??ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９構(gòu)建ＳＷｔ／２〃（Ｂ６，ＣＤ４５．２）小鼠由美國辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)??療中心的轉(zhuǎn)基因中心完成。兩個Ｌｏｘｐ位點分別被插入到５ＷＪ２第６外顯子的兩端。??分有兩個重要的、高度保守的結(jié)構(gòu)域：ＳＥＴ結(jié)構(gòu)域，ＳＲＩ結(jié)構(gòu)域。ＳＥＴ結(jié)構(gòu)域??是負責組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的催化結(jié)構(gòu)域，而ＳＲＩ結(jié)構(gòu)域則可以與ＲＮＡｐｏｌ?ＩＩ??結(jié)合。其中第６外顯子就位于ＳＥＴ結(jié)構(gòu)域中。在Ｃｒｅ的作用下，沿第６外顯??子的敲除會導致框移哭變以及哭變ｍＲＮＡ的無義衰變（ｎｏｎ－ｓｅｎｓｅ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｄｅｃａｙ，??ＮＭＤ），最終導致整個Ｓｅｔｄ２蛋白質(zhì)的缺失（圖１．２．１）。??ＡＷＳ?ＳＥＴ?ｐｏｓｌ－ＳＥＴ?ＷＷ?ＳＲＩ??

２ｘＴａｋａｒａ?ＰＣＲ?ｍａｓｔｅｒ?ｍｉｘ?７．５｜ａｌ??ｐｒｉｍｅｒｓ?（Ｆ＋Ｒ）?２ｊｘｌ??ＤＮＡ?＼［ｉｌ??Ｈ２０?４．５＾??總體積?１５ｐｌ??ＰＣＲ?反應條件為：９５°Ｃｘ２ｍｉｎ?預變性，（９５°Ｏ２０ｓ，?６５°Ｃｘ３０ｓ，７２°Ｏ９０ｓ）?ｘ３５，??７２°Ｃｘ５ｍｉｎ?終延伸。??根據(jù)Ｌｏｘｐ插入位點（圖１．２．２），基因型鑒定的引物設計如下：??Ｐ１?－ＴＧＧＧＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧＣ?ＡＡＴＡＴＣＴＣ，??Ｐ２－ＴＧＡＧＴＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＴＧＴＡＣ，??Ｐ３－ＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＣＧＧＡＡＣ，??Ｐ４－ＴＴＣＴＧＧＧ?ＡＡＴＣ?ＡＴＣＣ?ＡＴＧＧＴ。??

圖１．３．１?ＰＣＲ鑒定Ｌｏｘｐ插入??
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本文編號：2884072