人諾如病毒(Humannoroviruses,,huNoVs)可以引起全世界五分之一的急性胃腸炎,感染所有人群,臨床上以嘔吐、腹瀉、惡心、低燒為主要特征。諾如病毒(Noroviruses,,NoVs)具有遺傳多樣性,分為七個基因群。GⅠ和GⅡ基因群主要感染人類,根據(jù)衣殼區(qū)的命名原則至少包含35個基因型,其中,GⅡ基因群引起的流行最多,己經(jīng)明確有26個基因型。huNoVs可以識別組織血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)作為吸附因子或受體,影響宿主易感性。大量的研究己經(jīng)明確糖受體的結合特征對NoVs的流行至關重要,新流行株出現(xiàn),尤其是罕見毒株發(fā)展成為主要流行株往往會發(fā)生糖結合特性的改變。因此,全面了解罕見毒株、暴發(fā)流行株以及進化出的新基因型的糖結合特性,并闡明潛在糖結合特性變化的分子基礎對No Vs的預防控制具有重要意義。本研究主要分為以下三個部分:在GⅡ基因群中,GⅡ.13/21形成特異性遺傳分支,使用一個全新的、非傳統(tǒng)的糖受體結合位點(glycan binding site,GBS)與HBGAs 中的Lewis a(Lea)抗原結合。在糖結合特征中,GⅡ.13/21不同于傳統(tǒng)GⅡ基因型而具有新GBS的優(yōu)勢是什么。本研究通過表型和結構分析提出有力的證據(jù),GⅡ.13/21這種新的GBS通過共同的末端結構為β-半乳糖(β-galactose,β3-Gal)的形式識別一類寡糖。本研究發(fā)現(xiàn)在不同時期散發(fā)的六種GⅡ.13/21 huNoVs的P蛋白均結合三種末端結構均為β-Gal的寡糖,包括Ⅰ型前體(Lec),乳糖(lactose,Lac)以及mucin core 2;解析了 GⅡ.13 P二聚體與Lec和mucin core 2的復合物晶體結構,揭示β3-Gal是主要的糖結合位點,這些說明GⅡ.13/21的GBS有著廣泛的結合譜,這是其靶向人群的優(yōu)勢。于此同時,發(fā)現(xiàn)脫脂奶粉和乳糖可以有效地抑制GⅡ.13/21 P蛋白與寡糖唾液的結合,說明脫脂奶粉和乳糖可以充當誘餌受體而抑制病毒的感染,可能導致GⅡ.13/21病毒的低流行。2016-2017年冬季一株罕見的重組毒株GⅡ.P16-GⅡ.2在多個國家暴發(fā)流行,同期出現(xiàn)的有GⅡ.P16-GⅡ.1。在以往的報道中,GⅡ.2和GⅡ.1不與HBGAs結合,結構解析發(fā)現(xiàn)GⅡ.2衣殼蛋白的Asp382和GⅡ.1衣殼蛋白的Asp375與HBGAs結合的方向發(fā)生反轉。那么,由罕見毒株發(fā)展成為暴發(fā)流行株,GⅡ.2和GⅡ.1的糖受體結合情況是否發(fā)生改變。本研究中通過一系列功能實驗、結構解析明確了 2016年暴發(fā)流行株GⅡ.2以及同一時間出現(xiàn)的GⅡ.1衣殼蛋白的糖結合特征。通過結構解析表明GⅡ.2和GⅡ.1的衣殼蛋白HBGAs結合位點對應的關鍵氨基酸位點Asp382和Asp375發(fā)生改變,朝向與HBGAs結合的方向。NoVs為RNA病毒,進化速率較快。GⅡ.23/24/25是最近報道的NoVs新基因型,糖受體結合特征及其相互作用分子基礎仍不明確。本研究通過唾液和寡糖結合實驗明確了GⅡ.23/24/25 P蛋白與HBGAs的結合特征,發(fā)現(xiàn)其與A/B型唾液和H雙糖前體抗原結合;GⅡ.25與H雙糖抗原的復合物晶體結果表明其結構特征與傳統(tǒng)GⅡ相似,H雙糖與P蛋白的結合位點位于P 二 聚體的交界面,巖藻糖作為主要結合位點。這一結果表明諾如病毒GⅡ基因群在自然選擇壓力下,新基因型的進化特征趨向于傳統(tǒng)的GⅡ基因型的HBGAs結合特征。綜上所述,本研究利用功能實驗和結構解析擴大了 GⅡ基因群中GⅡ.13/21的結合譜,明確了其與糖抗原結合的獨特機制以及流行相關性,鑒定了流行重組毒株GⅡ.P16-GⅡ.2、GII.P16-GII.1以及新基因型GII.23/24/25的糖受體結合特征。這些為huNoVs暴發(fā)流行機制,宿主病毒相互作用,疫苗及抗病毒藥物研發(fā)提供參考。
【學位單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R373.2
【部分圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ?１?Ｔｈｅ?ｈｕｍａｎ?ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ?ｇｅｎｏｍｅ??１．２諾如病毒的遺傳多樣性??根據(jù)完整ＶＰ１蛋白序列的多樣性，ＮｏＶｓ分為七個基因群（ＧＩ－ＧＶＩＩ）（圖２）??［】３’１４］。除了?ＧＩＩ基因群中ＧＩＩ．ｉｌ／１８／１９這一分支感染豬、ＧＩＶ．２感染犬類外，ＧＩ、??ＧＩＩ、ＧＩＶ基因群主要引起人的感染，其中，ＧＩ和ＧＩＩ基因型是引起ｈｕＮｏＶｓ的??主要基因型，ＧＩＶ基因型在流行以及散發(fā)案例中檢出減少。ＧＩＩＩ基因簇主要感染??牛羊動物，ＧＶＩ．１感染鼠類，ＧＶ．２感染兔，ＧＩＶ．２感染貓和犬類［１５］，ＧＶＩ和ＧＶＩＩ??感染犬類。最近報道中，根據(jù)聚合酶去和衣殼區(qū)序列的雙命名原則，ＧＩＩ基因簇??的衣殼區(qū)出現(xiàn)了?ＧＩＩ．２３／２４／２５／２６四株新的基因型，以及三株初步認定的基因型，??ＧＩＩ．ＮＡ１－ＧＩＬＮＡ３［ｉ６１８］。??１．３諾如病毒的病原學及流行病學特征??ＮｏＶｓ成為一種常見的病原體是由許多因素導致，比如，感染劑量較低，少??于２０個病毒顆粒即可使人群感染Ｎ〇Ｖｓ［１９］；患病期間

分別在?ａ－１．２?巖藻糖轉移酶（ａ－ｌ，２ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＦＵＴ２）、ａ－１，３／４?巖藻??糖轉移酶（ａ－ｌ，３／４ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，?ＦＵＴ３）、Ａ／Ｂ?糖基轉移酶（ＡｏｒＢｅｎｚｙｍｅｓ）??下催化而成（圖３）。山于多個二糖前體以及ＨＢＧＡｓ的三個家族含有沉默等位基??因可能導致基因座上的顯性基因無效，所以人群中ＨＢＧＡｓ表型具有多態(tài)性。例??６??

將過夜培養(yǎng)的菌體以丨：１００的比例加入大的三角瓶中，按照小表達方法的??留取超聲破碎后的上清液進行蛋白純化。所有重組蛋白都要經(jīng)過ＧＳＴ親和層析??純化和酶切，經(jīng)過ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳后，在約３６ＫＤａ處可見目的蛋白（圖１．１），??Ｐ顆粒測定濃度后即可用于功能實驗。??／?“?／?／?／?／＃?，?／?／?／??／／／／／／?／＃／／／＃?／?／／??８０?Ｓ?８０??ＣＯ．?．???，??５８?必？如？一?ｍｍｍ?＊？＞？＊＊?－?ａ??＾?，?４６??。?働雜■？麵騰義一＊擊一—痛一??２５?｜ａＫｅ？?２￥懂：??２２：｜＾－?２２＿??圖１．１?Ｐ顆粒蛋白純化??Ｍ：蛋白分子量標準??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｐ?Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ?Ｐｒｏｔｅｉｎｓ??Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｍａｓｓ?ｍａｒｋｅｒ??ＳＣＩ?０６５、ＳＣＩ０６５／２９７、０８Ｎ２０４５?Ｐ?ｄｉｍｅｒ蛋白在ＧＳＴ親和層析之后，再由凝??膠過濾層析進一步純化，使用ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００】０／６００ＧＬ柱進行純化，ＵＶ２８０曲線在??４２??
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本文編號：2883242