研究背景:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,金葡菌)是一種流行廣泛、嚴(yán)重危害人類健康的致病菌,特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Meticillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA),是具有強致病性、多重耐藥的“超級細(xì)菌”,已成為臨床上治療的難題,嚴(yán)重威脅人類健康。2017年世界衛(wèi)生組織(WHO)列出了“12類最危險的‘超級細(xì)菌’”,金黃色葡萄球菌被列為“高度”優(yōu)先。美國每年約有9.4萬人嚴(yán)重感染MRSA,由此導(dǎo)致的死亡人數(shù)約為1.9萬。我國MRSA感染發(fā)病率較高,“全國細(xì)菌耐藥檢測網(wǎng)”調(diào)查顯示,內(nèi)地醫(yī)院革蘭氏陽性菌中金葡菌的臨床分離率占首位,院內(nèi)MRSA感染發(fā)病率約為8%,每年由MRSA感染造成的直接經(jīng)濟損失高達(dá)150億元。面對金葡菌耐藥性的不斷增加,免疫防治策略的相關(guān)研究有待加強,研發(fā)新的、有效的且不易產(chǎn)生耐藥的免疫防治藥物,如治療性抗體等,對于有效控制金葡菌感染、減少醫(yī)院感染死亡率,延緩耐藥發(fā)展,具有重要的意義。當(dāng)前,還沒有金葡菌的抗體藥物應(yīng)用于臨床,在國外開展的金葡菌治療性抗體臨床研究中,Inhibitex公司的INH-A21以表面凝聚因子A(ClfA)為靶點,Ⅲ期臨床試驗結(jié)果顯示實驗組與安慰劑組比較沒有顯著差異;Nabi公司以金葡菌莢膜為靶點的人免疫球蛋白在II期臨床試驗后也宣布失敗。而正在開展的金葡菌疫苗臨床試驗,如Pfizer公司的SA4Ag和GSK公司的GSK2392103A,其主要抗原成分均包含了四種金葡菌關(guān)鍵抗原。金葡菌毒力因子較多,致病因素復(fù)雜,單一的抗原靶點難以形成有效的保護,因此,基于金葡菌免疫防治的大量臨床前及臨床試驗研究結(jié)果,并總結(jié)相關(guān)研究失敗原因,金葡菌治療性抗體藥物應(yīng)該能夠涵蓋多個關(guān)鍵毒力因子,才能形成有效的保護。本課題組在前期金葡菌免疫防治研究中,利用反向疫苗學(xué)技術(shù)并結(jié)合大量動物免疫保護實驗,從金葡菌全基因組的2742個開放閱讀框中篩選出了5種免疫原性好、保守性高的免疫優(yōu)勢抗原:α-溶血素(Hla)、鐵離子表面決定蛋白B(IsdB)、金葡菌蛋白A(SpA)、腸毒素B(SEB)及錳離子轉(zhuǎn)運蛋白C(MntC),單個抗原免疫后的小鼠對金葡菌感染均具有一定的保護效果。以相應(yīng)去毒化突變的抗原為主要成分研發(fā)了重組金葡菌疫苗,在小鼠、大鼠金葡菌菌血癥、肺炎感染及骨折感染等致死性模型中均具有良好的免疫保護作用,并順利完成了Ⅰ期臨床試驗。研究目的:以重組金葡菌疫苗Ⅰ期臨床試驗受試者外周血漿細(xì)胞為抗體來源,利用單個漿細(xì)胞PCR等技術(shù)構(gòu)建抗體表達(dá)載體,將表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,ELISA檢測篩選該細(xì)胞中分泌的抗體,并將篩選的抗體毫克(mg)級表達(dá),分別從結(jié)合活性、親和力及中和活性進行體外評價,建立小鼠α-溶血素致死模型及MRSA252菌血癥致死模型評價單克隆抗體體內(nèi)免疫保護效果。為金葡菌治療性單克隆抗體藥物的研發(fā)奠定堅實的實驗基礎(chǔ)。研究方法:1.將突變后的5種金葡菌保護性抗原mHla、IsdB、SpA5、mSEB及MntC包被,對Ⅰ期臨床試驗受試者外周血血清進行ELISA檢測,篩選對5種保護性抗原均有高效價抗體的血清樣本,將高效價抗體血清對應(yīng)的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)用CD19、CD27及CD38等漿細(xì)胞表面標(biāo)志物熒光標(biāo)記抗體進行標(biāo)記,利用流式細(xì)胞術(shù)將PBMC中CD19~+、CD27~+及CD38~+,且CD3~-、CD14~-的細(xì)胞群分選成單個漿細(xì)胞。2.利用基因工程技術(shù),以裂解后的單個漿細(xì)胞中mRNA為模板進行RT PCR,擴增出抗體可變區(qū)基因的cDNA,而后以cDNA為模板,用特異性引物經(jīng)過兩輪PCR,擴增出抗體可變區(qū)基因。將抗體可變區(qū)基因與啟動子、恒定區(qū)基因及多聚A尾用重疊PCR進行連接,構(gòu)建抗體表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,以5種保護性抗原對細(xì)胞培養(yǎng)上清進行ELISA篩選。將篩選到的單克隆抗體線性表達(dá)載體克隆到pcDNA3.3質(zhì)粒上,并瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,純化細(xì)胞培養(yǎng)上清中的單克隆抗體。3.以金葡菌的5種抗原蛋白對不同濃度的單克隆抗體進行ELISA檢測,評價單克隆抗體與抗原的結(jié)合活性。將wtHla與Hla單克隆抗體共孵育后分別作用于兔紅細(xì)胞及A549細(xì)胞,檢測單克隆抗體對wtHla溶血及A549細(xì)胞殺傷作用的阻斷能力,評價其中和活性。4.建立wtHla腹腔攻毒小鼠致死模型及尾靜脈攻毒小鼠致死模型,將Hla單克隆抗體與wtHla體外共孵育后再攻毒,評價Hla單克隆抗體對wtHla攻毒小鼠的免疫保護作用。建立MRSA252小鼠菌血癥感染致死模型,在致死劑量攻毒后2h或攻毒前24小時尾靜脈注射抗體,評價抗體對小鼠MRSA252菌血癥感染致死模型的免疫保護效果。研究結(jié)果:1.ELISA篩選了52份重組金葡菌疫苗Ⅰ期臨床受試者外周血血清,得到了8份對5種保護性抗原均有高效價抗體的血清樣本,三次免疫后血清特異性抗體效價為免疫前的16-256倍,將該8份高效價抗體血清對應(yīng)的PBMC進行熒光標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)的分選,共分選到1120個漿細(xì)胞。2.利用漿細(xì)胞中mRNA為模板,進行RT PCR后再進行PCR,將PCR產(chǎn)物進行基因測序及抗體序列比對,得到了461對抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因,將重鏈、輕鏈可變區(qū)基因分別通過重疊PCR裝配成線性表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染表達(dá),ELISA篩選得到了39個陽性單克隆抗體,并進行抗體亞型及重鏈、輕鏈基因亞型的分析,39個抗體中,包含15個IgG1、3個IgG2、14個IgA及7個IgM亞型;抗體重鏈可變區(qū)基因由5個VH1、3個VH2、23個VH3、9個VH4及1個VH5亞型組成;抗體輕鏈可變區(qū)基因包括11個VK1、4個VK2、3個VK3、1個VK4、8個VL1、6個VL2、4個VL3、1個VL9及1個VL10亞型。對其中10株單克隆抗體進行了1mg以上的表達(dá)。3.ELISA檢測10株單克隆抗體的結(jié)合活性結(jié)果表明,Hla單克隆抗體M0411、IsdB單克隆抗體M0318、SpA5單克隆抗體M0659、M0662、SEB單克隆抗體M0283及MntC單克隆抗體M0686的結(jié)合活性較好,當(dāng)抗體濃度增加時,在450nm處的吸光度值也隨之增高。Western-blot結(jié)果證明,除SpA5單克隆抗體M0662識別構(gòu)象表位外,其余9株單克隆抗體均識別線性表位。wtHla溶血阻斷實驗及wtHla的A549細(xì)胞殺傷作用阻斷實驗表明,M0411具有很好的中和作用,能夠中和wtHla的體外毒性。4.分別以4μg/只、14μg/只的攻毒劑量,建立了wtHla尾靜脈、腹腔攻毒致死模型(死亡率≥90%)。在腹腔攻毒致死模型中,20μg/只的M0411具有100%的保護效果;在尾靜脈攻毒致死模型中,10μg/只及5μg/只的M0411均具有100%的保護效果。以每只小鼠9x10~8CFU的MRSA252建立了菌血癥致死感染模型(死亡率≥90%),在該模型中,每只小鼠在攻毒前24h注射20mg/kg體重的M0411,小鼠生存率達(dá)到100%,注射10mg/kg體重的M0411,小鼠生存率則為90%。每只小鼠在攻毒后2h注射10mg/kg體重的M0411,則沒有明顯的保護效果,生存率與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異。研究結(jié)論:1.通過ELISA篩選出了8份高抗體效價的血清樣本,并從對應(yīng)PBMC中分選了1120個漿細(xì)胞。2.通過PCR擴增、基因測序及序列比對,得到了461對抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因,并構(gòu)建了線性表達(dá)載體,從表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中篩選到了39株單克隆抗體,并毫克(mg)級表達(dá)純化了其中10株單克隆抗體,抗體純度較高。3.結(jié)合活性檢測結(jié)果表明,M0283、M0318、M0411、M0659、M0662及M0686的結(jié)合活性較好。Western-blot結(jié)果表明,M0662識別構(gòu)象表位,其余11株單克隆抗體均識別線性表位。4.體外中和實驗結(jié)果表明,M0411能夠阻斷wtHla對兔紅細(xì)胞的溶血及對A549細(xì)胞的殺傷作用,具有良好的中和活性。5.小鼠體內(nèi)免疫保護實驗結(jié)果表明,M0411能夠阻斷wtHla對小鼠的致死作用,同時,M0411對MRSA252攻毒小鼠的免疫保護率達(dá)到100%。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖 2-1. 對 5 種抗原蛋白均有高效價抗體的受試者血清抗體效價增加倍數(shù)Figure 2-1. Antibody titers increasing folds of serum samples with high changes towards five antigens表 2-8. 抗體篩選優(yōu)選次序2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)分選出 1120 個漿細(xì)胞

圖 2-2. 單克隆抗體可變區(qū)基因 DNA 電泳Fig 2-2. The DNA electrophoresis of mAb variable region gene. The heavy chain variable region(a);The kappa chain variable region(b); The lambda chain variable region(c)2.3.3 ELISA 篩選 293T 細(xì)胞培養(yǎng)上清得到 39 個單克隆抗體通過微量轉(zhuǎn)染試劑盒將 461 對線性表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，在低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) 72 小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，將金葡菌的 5 個保護性抗原 mHla、IsdB、SpA5、SEB 及 MntC 包被在酶標(biāo)板上，用 ELISA 的方法對細(xì)胞培養(yǎng)上清進行檢測，以陰性對照吸光度平均值的 2.1 倍作為 Cut-off 值，即陽性判定值，判定上清中是否有相應(yīng)抗體，共篩選到 39 個陽性抗體，450nm 波長處的吸光度值見圖 2-3e，這 39 個抗體分別來源于 4 份血清樣本，其在各血清樣本中的分布見圖 2-3（a-d）。其中 mHla 抗體的 M0398、M0399、M0411、M0699，IsdB 抗體的 M0318、M0400，SpA5 抗體的 M0659、M0662、M0676 及 M0715，mSEB 抗體的 M0313、M0487，以及 MntC 抗體的 M0686，450nm

圖 2-3. 各受試者血樣流式細(xì)胞術(shù)分選漿細(xì)胞數(shù)及單克隆抗體篩選 Plasma sorting by flow cytometry of blood samples and mAbs sorting. Single pnd positive antibodies of V7-1 (a) ; V7-127 (b); V7-132 (c); V7-135 (d); mAbs slinear expression cassettes transfected- 293T cells supernatant (e) 單克隆抗體的大量表達(dá)及純度鑒定線性表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)上清的ELISA篩選結(jié)果，對M030699、M0318、M0462、M0659、M0662、M0283 及 M0686 這 1克隆抗體優(yōu)先進行了 mg 級的轉(zhuǎn)染表達(dá)（M0400、M0313 及 M048后續(xù)克隆質(zhì)粒暫未成功，暫時未大量表達(dá)），其表達(dá)量見表 2-9。同隆抗體進行了鑒定，應(yīng)用蛋白 SDS-PAGE 凝膠分別進行還原性、非用以鑒定抗體的純度及抗體的重鏈、輕鏈，非還原性電泳結(jié)果證明載體瞬時轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并純化得到了純度較>90%），如圖 2-4a；還原性電泳結(jié)果表明（圖 2-4b），純化的得到
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