骨損傷危害人們的健康和生活,骨組織工程的建立為骨損傷治療帶來了新的希望。但研究發(fā)現(xiàn),組織工程骨對(duì)骨損傷(特別是極限骨缺損)的修復(fù)能力有限。究其原因,其一是種子細(xì)胞在體外的成骨分化能力有限,特別是羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs),其體外成骨分化能力顯著低于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,且成骨分化的調(diào)控及相關(guān)機(jī)制認(rèn)識(shí)不足。其二是組織工程骨內(nèi)部細(xì)胞活性差,易壞死。雖然以內(nèi)皮細(xì)胞為基礎(chǔ)的預(yù)血管化策略現(xiàn)已應(yīng)用,但在預(yù)血管化組織工程骨的構(gòu)建過程中,由于血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)與間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)相互作用及其分子機(jī)制仍不清楚,因此影響了構(gòu)建物的成骨和成血管功能,進(jìn)而影響體內(nèi)骨損傷的修復(fù)效果。針對(duì)上述關(guān)鍵問題,本研究采用小分子化合物丁酸鈉調(diào)控人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)的成骨分化,進(jìn)一步探究丁酸鈉調(diào)控羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)制。在血管內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞直接混合共培養(yǎng)體系中,考察在2D靜態(tài)培養(yǎng)和3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管樣結(jié)構(gòu)形成的影響,并探究?jī)煞N細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制。研究結(jié)果為體外調(diào)控共培養(yǎng)物的成骨分化、血管發(fā)生以及構(gòu)建預(yù)血管化的組織工程骨提供數(shù)據(jù)支持和策略指導(dǎo)。首先,將丁酸鈉(一種去乙�；敢种苿�)直接添加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,考察丁酸鈉的作用濃度和作用時(shí)間對(duì)hAMSCs增殖和成骨分化的影響。研究結(jié)果表明,低濃度的丁酸鈉(≤1.0mM)通過將細(xì)胞周期阻斷在G0/G1期影響hAMSCs增殖,而高濃度的丁酸鈉(5.0mM)則誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在丁酸鈉低濃度(0.50mM)短時(shí)間(3 d)作用下,對(duì)hAMSCs成骨分化具有一定的促進(jìn)作用;而丁酸鈉高濃度(1.0 mM)長(zhǎng)時(shí)間(14 d)作用下,對(duì)hAMSCs成骨分化產(chǎn)生一定的抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),丁酸鈉處于低濃度短時(shí)間處理,能夠促進(jìn)ERK信號(hào)分子的磷酸化,誘導(dǎo)H3K9超乙�；�(H3K9-Ace),降低組蛋白去乙酰化酶8(HDAC8)的表達(dá)水平,促進(jìn)成骨分化基因ALP、Runx2、OPN 和OCN 的轉(zhuǎn)錄以及 Runx2、TAZ、Collagentypel、OPN 及 OCN 的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化;而丁酸鈉處于高濃度長(zhǎng)時(shí)間處理,則降低H3K9的乙酰化程度,提高HDAC8的表達(dá)量,導(dǎo)致上述成骨分化標(biāo)志基因和蛋白的表達(dá)水平降低,從而抑制hAMSCs成骨分化。其次,通過建立2D細(xì)胞共培養(yǎng)模型,初步探究骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)與血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的相互作用機(jī)制。采用全骨髓貼壁法分離大鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)傳代培養(yǎng),檢測(cè)細(xì)胞表面抗原、細(xì)胞生長(zhǎng)及三向分化潛能,確定分離出的BMSCs具正常MSCs的功能。將BMSCs與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)以不同的接種比例直接混合共培養(yǎng)于4種培養(yǎng)基中,考察細(xì)胞比例、培養(yǎng)基對(duì)共培養(yǎng)物血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成和成骨分化的影響,確定適于共培養(yǎng)的細(xì)胞接種比例及培養(yǎng)基,即BMSCs與HUVECs以1:2共培養(yǎng)于OIM+1%ECGS中,建立了 BMSCs與HUVECs直接混合共培養(yǎng)體系。基于不同的2D共培養(yǎng)模型,考察直接接觸和間接接觸共培養(yǎng)對(duì)共培養(yǎng)物成骨分化和血管發(fā)生的影響,探究間隙連接、細(xì)胞因子及外泌小體在共培養(yǎng)體系中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在成骨誘導(dǎo)環(huán)境中,直接混合共培養(yǎng)對(duì)BMSCs的成骨分化具明顯的促進(jìn)作用,而在Transwell和條件培養(yǎng)基中間接共培養(yǎng)均不能促進(jìn)BMSCs的成骨分化。由此可見,HUVECs對(duì)BMSCs成骨分化的促進(jìn)依賴于兩種細(xì)胞的直接接觸,其中間隙連接蛋白Cx43在共培養(yǎng)初期共培養(yǎng)物中的表達(dá)量急劇上升,細(xì)胞因子和外泌小體均不是促進(jìn)BMSCs成骨分化的主要因素。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),HUVECs對(duì)BMSCs成骨分化的促進(jìn)作用涉及多種信號(hào)途徑,包括BMP信號(hào)途徑、Hedgehog信號(hào)途徑及Wnt信號(hào)途徑等。對(duì)共培養(yǎng)物血管發(fā)生影響的研究發(fā)現(xiàn),在成骨誘導(dǎo)條件下,無論BMSCs與HUVECs是否直接接觸,內(nèi)皮細(xì)胞血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成均受到嚴(yán)重阻礙。直接混合共培養(yǎng)后,內(nèi)皮細(xì)胞中成血管相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及關(guān)鍵受體蛋白的表達(dá)均顯著降低。此外,BMSCs與HUVECs直接混合共培養(yǎng)對(duì)兩種細(xì)胞表面抗原的表達(dá)無顯著影響,可將HUVECs細(xì)胞表面抗原CD 31作為后續(xù)共培養(yǎng)物流式分選的標(biāo)記�；谏鲜鰧�(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)一步考察間隙連接及由間隙連接通道介導(dǎo)的穿梭分子在直接混合共培養(yǎng)體系中對(duì)共培養(yǎng)物成骨分化和血管樣結(jié)構(gòu)形成的影響,探究BMSCs與HUVECs相互作用的分子機(jī)制。采用免疫熒光染色和染料穿梭實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 BMSCs與HUVECs能夠形成由Cx43介導(dǎo)的間隙連接,且該通道具有物質(zhì)傳遞的功能。通過采用間隙連接的抑制劑18GA和激活劑PTH,進(jìn)一步證明了兩種細(xì)胞間形成的間隙連接能夠影響共培養(yǎng)物的成骨分化和血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成,且發(fā)現(xiàn)了 Cxcl9和VEGF的表達(dá)水平與間隙連接蛋白Cx43具相關(guān)性。通過文獻(xiàn)調(diào)研及生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)miR-200b可能在共培養(yǎng)體系中發(fā)揮調(diào)控作用。在間隙連接激活劑PTH、抑制劑18GA和外泌小體抑制劑GW4869作用下檢測(cè)BMSCs與HUVECs單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)兩種細(xì)胞中miR-200b的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-200b可通過Cx43介導(dǎo)的間隙連接通道從BMSCs轉(zhuǎn)移到HUVECs。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了在BMSCs與HUVECs共培養(yǎng)時(shí),因miR-200b從BMSCs轉(zhuǎn)移到HUVECs,使BMSCs中miR-200b的含量降低,導(dǎo)致BMSCs中vegf-α的轉(zhuǎn)錄上調(diào),VEGF-A的表達(dá)提高,進(jìn)而促進(jìn)BMSCs的成骨分化;而miR-200b進(jìn)入HUVECs后,降低內(nèi)皮細(xì)胞中成血管相關(guān)基因ZEB 2、ETS 1、KDR及GATA 2的轉(zhuǎn)錄,從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。研究還發(fā)現(xiàn),TGF-β是調(diào)控miR-200b轉(zhuǎn)移的重要因子,在共培養(yǎng)體系中添加TGF-β的抑制劑SB431542或其中和性抗體,共培養(yǎng)物血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成得以部分恢復(fù)。最后,將BMSCs與HUVECs同時(shí)接種在Cultispher S微載體上,并在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系中采取“生長(zhǎng)-誘導(dǎo)”兩段式培養(yǎng),考察在3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中共培養(yǎng)物的成骨分化和血管發(fā)生,并比較3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)與2D靜態(tài)培養(yǎng)在關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的異同。研究表明,在3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境中經(jīng)成骨誘導(dǎo)后,共培養(yǎng)物的成骨分化能力顯著強(qiáng)于BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組,但共培養(yǎng)物血管樣結(jié)構(gòu)的形成明顯受阻,這與2D靜態(tài)培養(yǎng)的現(xiàn)象一致。通過qRT-PCR檢測(cè)關(guān)鍵基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn),在3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)體系中,共培養(yǎng)組中成骨分化標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于BMSCs單獨(dú)培養(yǎng)組,且cxcl9和vegfa呈現(xiàn)與cx43相同的變化趨勢(shì),與2D平板靜態(tài)培養(yǎng)的基因表達(dá)結(jié)果基本一致,僅在表達(dá)差異最顯著的時(shí)間點(diǎn)上略有不同。基于不同微組織的組合,初步嘗試預(yù)血管化骨微組織的構(gòu)建,在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中將BMSCs和HUVECs直接混合共培養(yǎng)1 d的微組織與成骨誘導(dǎo)14 d后形成的骨微組織以1:1組合,采用該策略制備的構(gòu)建物可以實(shí)現(xiàn)成骨和成血管功能。綜上所述,本研究探究了小分子化合物丁酸鈉對(duì)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響,并在2D靜態(tài)和3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下認(rèn)識(shí)了骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制,為體外調(diào)控共培養(yǎng)物成骨和成血管功能以及構(gòu)建預(yù)血管化的組織工程骨提供理論依據(jù)和策略指導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

具有非常重要的指導(dǎo)意義。ＭＳＣｓ與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用方式主要包括直接接觸和??間接接觸兩種，目前，用于研宄細(xì)胞間相互作用方式的模型主要建立在２Ｄ和３Ｄ培養(yǎng)??兩個(gè)水平上（圖１．４）。其中，２Ｄ直接接觸共培養(yǎng)一般在孔板、平皿或方瓶中實(shí)現(xiàn)，而間??接接觸共培養(yǎng)借助Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室、條件培養(yǎng)基或脫細(xì)胞基質(zhì)等。３Ｄ共培養(yǎng)一般采取直??接接觸的方式，包括有支架材料共培養(yǎng)和無支架材料共培養(yǎng)（細(xì)胞聚團(tuán)）。??ＩＢ?Ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｉｃ?ｃｅｌｌ，?？?Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ?ｃｄｌ，?Ｃｕｌｔｕｒｅ?ｍｅｄｉａ??（Ａ）?（Ｂ）??—＝＝＝??Ｉ，麵門！■？?麵??２Ｄ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｓｙ?ｓｔｅｍ??（Ｃ）?（Ｄ）??＿修??Ｗｉｔｈ?ｓｃａｆｆｏｌｄ?Ｗｉｔｈｏｕｔ?ｓｃａｆｆｏｌｄ??３Ｄ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｓｙｓｔｅｍ??圖１．４體外共培養(yǎng)模型＿??（Ａ）直接混合共培養(yǎng)；（Ｂ）?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ共培養(yǎng)；（Ｃ）有支架材料共培養(yǎng)；（Ｄ）細(xì)胞聚團(tuán)??Ｆｉｇ?１．４?Ｃｏｍｍｏｎ?ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ?ｓｙｓｔｅｍｓ?ｉｎ?ｖｉｔｒｏ??（Ａ）?Ｄｉｒｅｃｔ?ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ?ｏｎ?ｔｉｓｓｕｅ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｄｉｓｈ；?（Ｂ）?Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ?ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ；?（Ｃ）?Ｄｉｒｅｃｔ?ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ?ｗｉｔｈ?ｓｃａｆｆｏｌｄ；??（Ｄ）?Ｓｐｈｅｒｏｉｄ?ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ?ｗｉｔｈｏｕｔ?ｓｃａｆｆｏｌｄ??

１．４．１?ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ的生物合成過程及作用機(jī)制??ｍｉＲＮＡｓ由一組非編碼蛋白質(zhì)的短序列ＲＮＡ組成，其轉(zhuǎn)錄受到ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的調(diào)??控，序列具有高度的保守性［１４６］。ｍｉＲＮＡｓ的生物合成過程如圖１．６所示。首先，在基因??

自于鄰近細(xì)胞的直接接觸或細(xì)胞因子的旁分泌作用。細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控主要分為轉(zhuǎn)錄水平、??轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平的調(diào)控，而ｍｉＲＮＡｓ則在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上進(jìn)行??調(diào)控。ｍｉＲＮＡｓ對(duì)成骨分化的調(diào)控分為負(fù)向和正向兩種作用效果（圖１．７）。??

本文編號(hào)：2876508