發(fā)布時(shí)間：2020-10-31 13:32

　　 研究背景和目的:H6N1亞型禽流感病毒在水禽和陸禽中廣泛流行并反復(fù)傳播到哺乳動(dòng)物,其宿主范圍進(jìn)一步擴(kuò)大,增加了適應(yīng)性突變和基因重配的機(jī)率,并可能進(jìn)化演變成感染人并在人群中傳播的的新型流感病毒突變株,從而具有引發(fā)新一輪流感大爆發(fā)的潛能。更值得注意的是,該病毒的一些關(guān)鍵氨基酸已替換,這可能會(huì)增加人型SAα-2,6Gal受體的親和力并有利于病毒在人復(fù)制。因此,我們除了預(yù)防高致病禽流感病毒H5N1、H7N9、H5N6之外,也不能忽視低致病性禽流感病毒H6N1亞型的潛在威脅。本文在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探索H6N1亞型禽流感病毒是否具有在豬和人呼吸道組織復(fù)制的潛能并篩選出其有效復(fù)制的基因特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法:1.禽流感病毒的篩選及擴(kuò)增將2株水禽鴨源性和3株陸禽鵪鶉源性的H6N1亞型禽流感病毒及課題組前期已篩選得到的1株H9N2亞型禽流感病毒(作陽性對(duì)照)進(jìn)行雞胚擴(kuò)增,測(cè)定HA滴度,并將收獲的尿囊液離心后分裝在凍存管中,保存于-80℃超低溫冰箱中待用。2.EID_(50)和TCID_(50)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)禽流感病毒將病毒液進(jìn)行10倍系列等比稀釋應(yīng)用EID_(50)(雞胚半數(shù)感染劑量)和TCID_(50)(組織細(xì)胞半數(shù)感染量)實(shí)驗(yàn),在體外感染實(shí)驗(yàn)前確定病毒感染接種的稀釋度。3.病毒體外感染豬呼吸道組織實(shí)驗(yàn)以安樂法處死巴馬香豬后,迅速解剖、分離豬呼吸道組織(氣管、支氣管、肺組織)并切成小組織塊,置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,將稀釋的病毒液體外感染豬呼吸道組織,并在感染后各時(shí)間點(diǎn)收集組織培養(yǎng)液及組織塊。雞胚和MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)上清液及組織研磨液,HA檢測(cè)鑒定,HE染色觀察組織病理學(xué)變化以及免疫組化法檢測(cè)病毒抗原的分布。4.病毒體外感染人呼吸道組織實(shí)驗(yàn)收集我校直屬醫(yī)院臨床相關(guān)手術(shù)中切除的新鮮人呼吸道組織(細(xì)支氣管、肺組織)并切成小組織塊,置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,將稀釋的病毒液體外感染人呼吸道組織,并在感染后各時(shí)間點(diǎn)收集組織培養(yǎng)液及組織塊。雞胚和MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)上清液及組織研磨液,HA檢測(cè)鑒定,HE染色觀察組織病理學(xué)變化以及免疫組化法檢測(cè)病毒抗原的分布。5.病毒基因測(cè)序和篩選關(guān)鍵基因標(biāo)記分別提取5株禽流感病毒的RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,PCR反應(yīng)擴(kuò)增,測(cè)序反應(yīng)。用GCG 10.2編輯和處理基因序列,Mega 7.0和Bioedit 7.0.9上進(jìn)行序列比較和同源性分析。綜合豬和人呼吸道體外感染試驗(yàn)和基因測(cè)序的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分析具有在豬和人呼吸道組織復(fù)制的病毒各基因片段的變化,最終篩選出病毒在豬和人呼吸道組織復(fù)制的基因特點(diǎn),特別是關(guān)鍵分子標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.EID_(50)和TCID_(50)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)禽流感病毒情況:應(yīng)用EID_(50)檢測(cè)5株H6N1亞型禽流感病毒,發(fā)現(xiàn)病毒Qa/ST/22124/2005(簡稱ST22124)的EID_(50)值最高,毒力最強(qiáng);病毒Qa/ST/238/2000(簡稱ST238)和DK/JX/35634/2016(簡稱JX35634)的EID_(50)值最低,毒力最弱。同時(shí),應(yīng)用TCID_(50)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5株H6N1亞型禽流感病毒,發(fā)現(xiàn)病毒ST22124的TCID_(50)值最高,毒力最強(qiáng);病毒JX35634的TCID_(50)值最低,毒力最弱。2.禽流感病毒H6N1在體外豬呼吸道組織的復(fù)制:雞胚分離培養(yǎng)組織培養(yǎng)液和組織研磨上清液中病毒,培養(yǎng)液中HA滴度均大于256,且感染前后會(huì)出現(xiàn)滴度變化,其中以Qa/ST/3329/2001(簡稱ST3329)和ST22124兩株病毒感染后產(chǎn)生的HA滴度較高。而在MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)中,HA滴度小于128或陰性。HE染色顯示病毒感染氣管和肺組織后均出現(xiàn)不同程度的組織結(jié)構(gòu)破壞,氣管黏膜上皮脫落壞死,肺泡細(xì)胞壞死。免疫組化檢測(cè)顯示肺組織部分和肺巨噬細(xì)胞內(nèi)病毒NP抗原陽性,而氣管和支氣管僅出現(xiàn)個(gè)別細(xì)胞內(nèi)病毒NP抗原陽性。其中ST3329和ST22124病毒株感染肺組織后,病毒NP抗原在細(xì)胞表達(dá)較多。3.禽流感病毒H6N1在體外人呼吸道組織的復(fù)制:雞胚分離培養(yǎng)組織培養(yǎng)液和組織研磨上清液中病毒,培養(yǎng)液中HA滴度均大于256,且感染前后也出現(xiàn)滴度變化,其中以ST22124和ST3329兩株病毒感染后產(chǎn)生的HA滴度較高。而在MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)中,HA滴度小于128或陰性。HE染色顯示病毒感染支氣管和肺組織后均出現(xiàn)不同程度的組織結(jié)構(gòu)破壞、肺泡上皮細(xì)胞壞死和少量炎性細(xì)胞浸潤。免疫組化檢測(cè)顯示肺組織部分肺泡細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)病毒NP抗原陽性,而在細(xì)支氣管中,病毒NP抗原僅出現(xiàn)少量陽性。其中ST22124和ST3329兩株病毒感染肺組織后,其病毒NP抗原在細(xì)胞表達(dá)較多。4.禽流感病毒H6N1在豬和人復(fù)制的基因特點(diǎn):HA基因氨基酸序列分析結(jié)果,5株H6N1病毒的HA裂解位點(diǎn)序列均為PQIETG/GL,僅有單個(gè)堿性氨基酸,表現(xiàn)為低致病性禽流感病毒的分子特征。陸禽鵪鶉Qa/ST/3329/2001(簡稱ST3329)和ST22124的HA出現(xiàn)P186S、S158T,而ST238僅出現(xiàn)S158T,JX35634僅出現(xiàn)S158T,結(jié)合ST22124和ST3329兩株病毒易于在豬和人復(fù)制的特點(diǎn),提示HA出現(xiàn)S158T或S158T、P186S雙聯(lián)突變有助于病毒具有感染豬和人的潛能。NA氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),ST238、ST3329和ST22124三株陸禽動(dòng)物源性病毒的NA基因頸部有19aa的缺失,其位點(diǎn)均位于第54-72位,這種NA頸部氨基酸的缺失有利于增強(qiáng)流感病毒對(duì)宿主的毒力和復(fù)制力。5株病毒PB2第627、701位均分別為谷氨酸(E)、天冬氨酸(D),且PB1-F2的第66位均為天冬酰胺(N),未出現(xiàn)突變。研究結(jié)論:1.水禽鴨和陸禽鵪鶉H6N1亞型禽流感病毒在豬及人呼吸道組織有效復(fù)制,提示H6N1亞型禽流感病毒具有跨越種間屏障分別從水禽和陸禽直接感染豬及人的潛能,病毒在豬和人呼吸道組織中持續(xù)復(fù)制有助于病毒進(jìn)化演變成具有感染人以及人際傳播能力的新型流感病毒的可能。2.陸禽鵪鶉H6N1亞型禽流感病毒ST22124和ST3329在豬和人的呼吸道組織中復(fù)制能力較強(qiáng),屬具有感染人潛能的病毒株。3.H6N1亞型流感病毒均表現(xiàn)為低致病性禽流感病毒特征,但也存在與病毒毒力、宿主嗜性相關(guān)的基因突變,陸禽鵪鶉ST22124和ST3329的HA出現(xiàn)S158T、P186S雙聯(lián)突變、NA基因序列頸部第54-72位19aa缺失,結(jié)合該2株病毒均可在豬和人支氣管和肺泡組織有效復(fù)制的結(jié)果,提示這些突變和缺失有利于陸禽H6N1病毒感染豬和人。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R373.13
【部分圖文】：

表 3-4 6 株禽流感病毒體外感染豬肺組織后研磨液的滴度測(cè)定結(jié)果（MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)）Tab.3-4 Results of HAtiter determination of swine lung infected with 6 strains of avian influenza virusin vitro（MDCK cells cultivation）病毒名稱 感染前 感染后 HA 滴度Viruses HA 滴度 12h 24h 36h 48h 72hDK/ST/3208/2012 1:2048 - - - - -DK/GY/2462/2007 1:1024 - - - - -DK/JX/35634/2016 1:512 - - - - -Qa/ST/238/2000 1:2048 1:128 1:16 - 1:64 -Qa/ST/3329/2001 1:2048 - - - - -Qa/ST/22124/2005 1:2048 1:64 - - 1:8 -PBS - - - - - -

- 49 --3 H6N1 亞型 AIV 體外感染豬氣管組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，氣管黏膜上皮與基底層分離（B、CF、G），細(xì)胞脫落壞死（B、D、F、G），如箭頭所示，空白對(duì)照(A)，200×3-3 The pathology c hange of swine tr acheal tis sue in fected with H6N1 subtype in vitro, Traosal epithelium and basal layer separation（B、C、D、E、F、G）, cell detachment and necrosisF、G）, as shown by the arrows，mock control (A), 200 ×

- 50 --4 H6N1 亞型 AIV 體外感染豬肺組織結(jié)構(gòu)變化, 肺泡上皮結(jié)構(gòu)破壞（B、C、D、E、F、G出現(xiàn)壞死并脫落到腔內(nèi)（E、F、G），如箭頭所示，空白對(duì)照(A)，200×3-4 The pathology change of H6N1 subtype AIV infection in vitro swine lung tissue Alveolar epicture destruction（B、C、D、E、F、G）, the cells necrosis and shed into alveolar cavity c（C、, as shown by the arrows，mock control (A), 200×
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本文編號(hào)：2864009