目的旨在篩選出能穩(wěn)定敲減及過(guò)表達(dá)泛素連接酶E6AP的細(xì)胞株,在這兩種情況下比較已知底物Arc的泛素化修飾區(qū)別,以期進(jìn)一步闡明E6AP通過(guò)調(diào)控底物的泛素化進(jìn)而影響底物下游功能的機(jī)理。方法從人胚腎293細(xì)胞中提取RNA再反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以c DNA為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增得到E6AP目的條帶,將E6AP基因克隆至p LVXIRES-mCherry質(zhì)粒,構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒;同時(shí),合成可特異性結(jié)合E6AP mRNA的shRNA,并克隆至GIPZ質(zhì)粒,構(gòu)建敲減質(zhì)粒。結(jié)果通過(guò)嘌呤霉素篩選得到敲減及過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)比較底物的泛素化修飾區(qū)別。結(jié)論成功構(gòu)建E6AP敲減及過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,并能相應(yīng)影響HEK-293細(xì)胞中底物Arc的泛素化修飾水平。
【部分圖文】：

以人胚腎293細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的全長(zhǎng)E6AP片段大小符合預(yù)期值(圖1A)。構(gòu)建好的質(zhì)粒通過(guò)雙酶切驗(yàn)證，可看到載體與目的基因條帶分開(kāi)，條帶大小與預(yù)期一致(圖1B)，測(cè)序結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染shE6AP質(zhì)粒至HEK-293細(xì)胞

藥物篩選維持一個(gè)月后，通過(guò)比較不同組細(xì)胞株中E6AP表達(dá)情況，可發(fā)現(xiàn)sh E6AP2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株對(duì)E6AP表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)(圖2D、2E)，故以此穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)研究。2.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染E6AP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒至HEK-293細(xì)胞

藥物篩選維持一個(gè)月后，我們挑取6個(gè)細(xì)胞株通過(guò)western實(shí)驗(yàn)比較不同細(xì)胞株中E6AP表達(dá)情況，結(jié)果顯示3個(gè)細(xì)胞株與對(duì)照組相比均能顯著增強(qiáng)E6AP表達(dá)(圖3D、3E)，其余3個(gè)細(xì)胞株與對(duì)照組相比E6AP表達(dá)量差別不大，我們猜測(cè)可能是由于E6AP過(guò)表達(dá)基因未能成功整合至細(xì)胞自身的基因組上，故而未能增強(qiáng)E6AP表達(dá)。將篩選成功的3個(gè)細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行后續(xù)研究。2.6 E6AP敲減及過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株對(duì)底物Arc的泛素化影響(圖4)
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