目的:構(gòu)建酸敏感離子通道3(Acid-sensing ion channels 3,ASIC3)基因干擾質(zhì)粒,驗證重組質(zhì)粒干擾效率,并獲得sh-ASIC3慢病毒;建立小鼠轉(zhuǎn)移皮膚癌痛模型并行sh-ASIC3慢病毒鞘內(nèi)注射處理,研究ASIC3在轉(zhuǎn)移皮膚癌痛模型小鼠中的作用。方法:利用GenBank獲取ASIC3基因序列合成相應(yīng)干擾序列,通過T4 DNA連接酶將ASIC3基因片段連接至環(huán)狀Plko.1-Puro載體上,獲得重組干擾ASIC3質(zhì)粒(sh-ASIC3),通過轉(zhuǎn)染三種神經(jīng)細(xì)胞(PC12、N2a、BV2),運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)和免疫印跡技術(shù)(Western blotting)驗證sh-ASIC3質(zhì)粒干擾效率。隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲取sh-ASIC3慢病毒,運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測病毒滴度。于健康雌性Balb/c小鼠左后趾皮下注射小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1),數(shù)量約2×10~5個,建立小鼠轉(zhuǎn)移皮膚癌痛模型。建模成功后運(yùn)用完全隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠進(jìn)行分組處理,各組小鼠分別在接種4T1后隔天測量小鼠熱縮足反射潛伏期(Paw Withdrawal Thermal Latency,PWTL),在接種4T1癌細(xì)胞成功的小鼠第9天按實(shí)驗分組行鞘內(nèi)及局部注射慢病毒處理,隨后隔天行PWTL測試,比較慢病毒處理前后PWTL閾值的變化。慢病毒處理13天后采用脊髓離斷法處死小鼠,獲取L4-5脊髓背根神經(jīng)組織。運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測脊髓背根神經(jīng)(dorsal root ganglion,DRG)中ASIC3的變化。結(jié)果:菌液PCR結(jié)果提示ASIC3干擾序列插入載體成功,測序結(jié)果表明干擾質(zhì)粒ASIC3的插入序列與Genbank標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致;RT-PCR及Western blo tting檢測結(jié)果表明,三種神經(jīng)細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)量sh-ASIC3慢病毒感染組較sh-EGFP慢病毒感染組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);小鼠左后趾皮下注射4T1癌細(xì)胞后,接種側(cè)出現(xiàn)明顯紅腫及活動障礙,PWTL測試閾值較正常組縮短,且RT-sqPCR及Western blotting結(jié)果提示接種4TI癌細(xì)胞小鼠DRG中ASIC3表達(dá)量較正常組明顯增高;皮膚癌痛小鼠行鞘內(nèi)注射sh-ASIC3干擾慢病毒處理后較腫瘤局部注射sh-ASIC3干擾慢病毒及鞘內(nèi)注射sh-E GFP干擾慢病毒組PWTL測試閾值明顯增高,小鼠DRG中ASIC3免疫組化結(jié)果同樣與PWTL結(jié)果一致。結(jié)論:成功構(gòu)建sh-ASIC3慢病毒干擾質(zhì)粒;皮下注射乳腺癌細(xì)胞的雌性小鼠PWTL較正常小鼠明顯縮短,且ASIC3表達(dá)量同時增高,表明成功建立皮膚癌痛模型小鼠,并說明ASIC3介導(dǎo)小鼠皮膚癌痛的產(chǎn)生;鞘內(nèi)注射sh-ASIC3慢病毒可提高癌痛小鼠PWTL閾值,免疫組化結(jié)果進(jìn)一步佐證了其機(jī)制可能與ASIC3表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.5;R-332
【部分圖文】：

圖 1 ASIC 存在于外周神經(jīng)末梢&腫瘤與感覺神經(jīng)元的聯(lián)系Fig 1 ASIC exists in peripheral nerve endings & The connection between tumor and sensory neurons感性，但會降低機(jī)械感受器對有害刺激的敏感性[21]。有研究者認(rèn)為外周致敏是骨癌疼痛的主要誘因，周圍感覺神經(jīng)通常受神經(jīng)支配的組織的纖維被骨癌和癌癥相關(guān)免疫細(xì)胞釋放的產(chǎn)物激活和敏化，受影響的背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元表現(xiàn)出異位自發(fā)活動和過度興奮，這部分導(dǎo)致嚴(yán)重的持續(xù)慢性疼痛[22,23]。位于疼痛感覺神經(jīng)元胞體以及神經(jīng)纖維膜表面的受體或離子通道是感知各種傷害性刺激的重要結(jié)構(gòu)，因此，癌性疼痛的產(chǎn)生與相關(guān)受體或離子通道性狀的改變密切相關(guān)。隨著近年來癌性疼痛的研究逐漸增多，尤其是分子機(jī)制的研究，旨在為癌性疼痛的

圖 2.1 A: 3 種 sh-ASIC3 基因序列成功插入載體；B: 質(zhì)粒 A 測序結(jié)果Fig 2.1 A: Three sh-ASIC3 gene sequence was successfully inserted into the vector;B: Plasmid A sequencing results4.2 ASIC3 基因 mRNA 及蛋白相對表達(dá)量的變化RT-PCR 檢測結(jié)果表明，sh-ASIC3 慢病毒感染組較 sh-EGFP 慢病毒感染組PC12、BV2、N2a 細(xì)胞中 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在 Western blotting 結(jié)果顯示，sh-ASIC3 慢病毒感染組較 sh-EGFP 慢病毒感染組蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。(圖 2.2）

、結(jié)痂等現(xiàn)象，患側(cè)肢體活動出現(xiàn)明顯受限，對側(cè)肢體活動正常，空白對照假手術(shù)組小鼠生長情況及小鼠足底注射部位無明顯變化，提示小鼠皮膚癌痛建立成功（如圖 3.1）。 三組小鼠接種后，進(jìn)食排便均無明顯改變，一般情。小鼠接種前后隔天觀察并記錄小鼠接種側(cè)瘤體變化情況及行為學(xué)自由行走評分。結(jié)果顯示：小鼠接種前 CIP 組、C 組和 S 組小鼠行為學(xué)自由行走疼痛均為 0 分。接種后，C 組和 S 組小鼠行為學(xué)自由行走疼痛評分無統(tǒng)計學(xué)意P＞0.05）。CIP 組與其余兩組相比，隨著腫瘤大小的增長，小鼠行為學(xué)自由疼痛評分呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢，且從接種后 5 天起差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P.05）。（如表 1，圖 3.2）
【參考文獻(xiàn)】

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1 周俊;王漢兵;仲吉英;鄭雪琴;林森;黃振興;黃騰;楊承祥;;鞘內(nèi)注射TRESK基因重組腺病毒對神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓p38MAPK和ERK活性的影響[J];中華麻醉學(xué)雜志;2015年04期

2 胡四平;汪衛(wèi)星;劉洋;吳鶴芬;余亮;劉鶴;王翔;;局部注射酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利對脛骨癌痛大鼠疼痛行為學(xué)的影響[J];浙江醫(yī)學(xué);2013年08期

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1 華佳;帕瑞昔布鈉對轉(zhuǎn)移性皮膚癌痛小鼠模型ASIC3表達(dá)和作用的影響[D];江蘇大學(xué);2018年

本文編號：2858535