目的:構(gòu)建酸敏感離子通道3(Acid-sensing ion channels 3,ASIC3)基因干擾質(zhì)粒,驗(yàn)證重組質(zhì)粒干擾效率,并獲得sh-ASIC3慢病毒;建立小鼠轉(zhuǎn)移皮膚癌痛模型并行sh-ASIC3慢病毒鞘內(nèi)注射處理,研究ASIC3在轉(zhuǎn)移皮膚癌痛模型小鼠中的作用。方法:利用GenBank獲取ASIC3基因序列合成相應(yīng)干擾序列,通過(guò)T4 DNA連接酶將ASIC3基因片段連接至環(huán)狀Plko.1-Puro載體上,獲得重組干擾ASIC3質(zhì)粒(sh-ASIC3),通過(guò)轉(zhuǎn)染三種神經(jīng)細(xì)胞(PC12、N2a、BV2),運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)和免疫印跡技術(shù)(Western blotting)驗(yàn)證sh-ASIC3質(zhì)粒干擾效率。隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲取sh-ASIC3慢病毒,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒滴度。于健康雌性Balb/c小鼠左后趾皮下注射小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1),數(shù)量約2×10~5個(gè),建立小鼠轉(zhuǎn)移皮膚癌痛模型。建模成功后運(yùn)用完全隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠進(jìn)行分組處理,各組小鼠分別在接種4T1后隔天測(cè)量小鼠熱縮足反射潛伏期(Paw Withdrawal Thermal Latency,PWTL),在接種4T1癌細(xì)胞成功的小鼠第9天按實(shí)驗(yàn)分組行鞘內(nèi)及局部注射慢病毒處理,隨后隔天行PWTL測(cè)試,比較慢病毒處理前后PWTL閾值的變化。慢病毒處理13天后采用脊髓離斷法處死小鼠,獲取L4-5脊髓背根神經(jīng)組織。運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)脊髓背根神經(jīng)(dorsal root ganglion,DRG)中ASIC3的變化。結(jié)果:菌液PCR結(jié)果提示ASIC3干擾序列插入載體成功,測(cè)序結(jié)果表明干擾質(zhì)粒ASIC3的插入序列與Genbank標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致;RT-PCR及Western blo tting檢測(cè)結(jié)果表明,三種神經(jīng)細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)量sh-ASIC3慢病毒感染組較sh-EGFP慢病毒感染組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);小鼠左后趾皮下注射4T1癌細(xì)胞后,接種側(cè)出現(xiàn)明顯紅腫及活動(dòng)障礙,PWTL測(cè)試閾值較正常組縮短,且RT-sqPCR及Western blotting結(jié)果提示接種4TI癌細(xì)胞小鼠DRG中ASIC3表達(dá)量較正常組明顯增高;皮膚癌痛小鼠行鞘內(nèi)注射sh-ASIC3干擾慢病毒處理后較腫瘤局部注射sh-ASIC3干擾慢病毒及鞘內(nèi)注射sh-E GFP干擾慢病毒組PWTL測(cè)試閾值明顯增高,小鼠DRG中ASIC3免疫組化結(jié)果同樣與PWTL結(jié)果一致。結(jié)論:成功構(gòu)建sh-ASIC3慢病毒干擾質(zhì)粒;皮下注射乳腺癌細(xì)胞的雌性小鼠PWTL較正常小鼠明顯縮短,且ASIC3表達(dá)量同時(shí)增高,表明成功建立皮膚癌痛模型小鼠,并說(shuō)明ASIC3介導(dǎo)小鼠皮膚癌痛的產(chǎn)生;鞘內(nèi)注射sh-ASIC3慢病毒可提高癌痛小鼠PWTL閾值,免疫組化結(jié)果進(jìn)一步佐證了其機(jī)制可能與ASIC3表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.5;R-332
【部分圖文】：

圖 1 ASIC 存在于外周神經(jīng)末梢&腫瘤與感覺(jué)神經(jīng)元的聯(lián)系Fig 1 ASIC exists in peripheral nerve endings & The connection between tumor and sensory neurons感性，但會(huì)降低機(jī)械感受器對(duì)有害刺激的敏感性[21]。有研究者認(rèn)為外周致敏是骨癌疼痛的主要誘因，周圍感覺(jué)神經(jīng)通常受神經(jīng)支配的組織的纖維被骨癌和癌癥相關(guān)免疫細(xì)胞釋放的產(chǎn)物激活和敏化，受影響的背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元表現(xiàn)出異位自發(fā)活動(dòng)和過(guò)度興奮，這部分導(dǎo)致嚴(yán)重的持續(xù)慢性疼痛[22,23]。位于疼痛感覺(jué)神經(jīng)元胞體以及神經(jīng)纖維膜表面的受體或離子通道是感知各種傷害性刺激的重要結(jié)構(gòu)，因此，癌性疼痛的產(chǎn)生與相關(guān)受體或離子通道性狀的改變密切相關(guān)。隨著近年來(lái)癌性疼痛的研究逐漸增多，尤其是分子機(jī)制的研究，旨在為癌性疼痛的

圖 2.1 A: 3 種 sh-ASIC3 基因序列成功插入載體；B: 質(zhì)粒 A 測(cè)序結(jié)果Fig 2.1 A: Three sh-ASIC3 gene sequence was successfully inserted into the vector;B: Plasmid A sequencing results4.2 ASIC3 基因 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表明，sh-ASIC3 慢病毒感染組較 sh-EGFP 慢病毒感染組PC12、BV2、N2a 細(xì)胞中 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在 Western blotting 結(jié)果顯示，sh-ASIC3 慢病毒感染組較 sh-EGFP 慢病毒感染組蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。(圖 2.2）

、結(jié)痂等現(xiàn)象，患側(cè)肢體活動(dòng)出現(xiàn)明顯受限，對(duì)側(cè)肢體活動(dòng)正常，空白對(duì)照假手術(shù)組小鼠生長(zhǎng)情況及小鼠足底注射部位無(wú)明顯變化，提示小鼠皮膚癌痛建立成功（如圖 3.1）。 三組小鼠接種后，進(jìn)食排便均無(wú)明顯改變，一般情。小鼠接種前后隔天觀察并記錄小鼠接種側(cè)瘤體變化情況及行為學(xué)自由行走評(píng)分。結(jié)果顯示：小鼠接種前 CIP 組、C 組和 S 組小鼠行為學(xué)自由行走疼痛均為 0 分。接種后，C 組和 S 組小鼠行為學(xué)自由行走疼痛評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意P＞0.05）。CIP 組與其余兩組相比，隨著腫瘤大小的增長(zhǎng)，小鼠行為學(xué)自由疼痛評(píng)分呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)，且從接種后 5 天起差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P.05）。（如表 1，圖 3.2）
【參考文獻(xiàn)】

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1 周俊;王漢兵;仲吉英;鄭雪琴;林森;黃振興;黃騰;楊承祥;;鞘內(nèi)注射TRESK基因重組腺病毒對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓p38MAPK和ERK活性的影響[J];中華麻醉學(xué)雜志;2015年04期

2 胡四平;汪衛(wèi)星;劉洋;吳鶴芬;余亮;劉鶴;王翔;;局部注射酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利對(duì)脛骨癌痛大鼠疼痛行為學(xué)的影響[J];浙江醫(yī)學(xué);2013年08期

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1 華佳;帕瑞昔布鈉對(duì)轉(zhuǎn)移性皮膚癌痛小鼠模型ASIC3表達(dá)和作用的影響[D];江蘇大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2858535