目的:生物信息學分析和預測豬帶絳蟲(Taenia solium,Ts)14-3-3基因家族及其編碼蛋白的序列、結(jié)構(gòu)與進化特征,分析Ts14-3-3基因家族在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴階段的表達差異,原核表達Ts14-3-3.3基因并制備Ts14-3-3.3多克隆抗體,分析Ts14-3-3.3蛋白的組織定位情況,為該蛋白的進一步研究奠定基礎(chǔ)。方法:1.搜索Gene DB數(shù)據(jù)庫中豬帶絳蟲全基因組數(shù)據(jù),利用生物信息學分析工具及各類軟件包,分析和預測Ts14-3-3基因家族的基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白質(zhì)的理化特性、二級結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、三級結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化樹等。2.采集流行區(qū)豬帶絳蟲病人成蟲標本,建立囊蟲病豬模型,收集豬囊尾蚴,采用實時熒光定量PCR方法檢測Ts14-3-3基因家族在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴階段的相對表達量。3.將Ts14-3-3.3基因克隆至原核表達質(zhì)粒p CznⅠ中,在大腸桿菌Arctic Express中用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達,通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析其表達產(chǎn)物,用His Link親和層析柱進行純化,免疫印跡法(Western blot)鑒定純化后的Ts14-3-3.3重組蛋白。4.將純化的Ts14-3-3.3重組蛋白免疫新西蘭兔,制備Ts14-3-3.3多克隆抗體,Western blot和免疫組化法檢測Ts14-3-3.3天然蛋白在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴的定位。結(jié)果:1.通過對豬帶絳蟲全基因組數(shù)據(jù)庫搜索,共獲得6個豬帶絳蟲Ts14-3-3基因,基因結(jié)構(gòu)均由外顯子和內(nèi)含子組成,其編碼蛋白分子質(zhì)量介于26.88~29.33KD之間,蛋白結(jié)構(gòu)均為二聚體形式,分別位于4個不同的進化枝上。2.熒光定量PCR結(jié)果表明,6個Ts14-3-3基因在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴階段均有表達,Ts14-3-3.1、Ts14-3-3.2、Ts14-3-3.3和Ts14-3-3.4在囊尾蚴階段表達量較高,Ts14-3-3.5和Ts14-3-3.6在成蟲階段表達量較高。3.成功構(gòu)建豬帶絳蟲重組表達質(zhì)粒p CznⅠ-Ts14-3-3.3,經(jīng)IPTG誘導表達,獲得以可溶性形式高效表達的Ts14-3-3.3重組蛋白,分子質(zhì)量約29.31 KD,純化后帶有His標簽的Ts14-3-3.3重組蛋白能被抗血清所識別。4.用純化的Ts14-3-3.3重組蛋白免疫新西蘭兔,獲得了高效價的Ts14-3-3.3多克隆抗體,Western blot和免疫組化結(jié)果顯示,Ts14-3-3.3天然蛋白在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴中均有表達。結(jié)論:1.初步獲得了豬帶絳蟲Ts14-3-3基因家族的6個成員,其編碼蛋白包含典型的14-3-3蛋白結(jié)構(gòu)域,具有較高的序列保守性。2.豬帶絳蟲Ts14-3-3基因家族的6個成員在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴階段均有表達。3.成功構(gòu)建p Czn I-Ts14-3-3.3原核表達質(zhì)粒,Ts14-3-3.3重組蛋白可在大腸桿菌中以可溶形式高效表達。4.Ts14-3-3.3天然蛋白在豬帶絳蟲成蟲和囊尾蚴階段均有表達。
【學位單位】：遵義醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.734;R383.3
【部分圖文】：

遵義醫(yī)科大學碩士學位論文 李想TsM_000804900、TsM_000747500 和 TsM_001162700 編碼基因由 3 個外顯子和 2個內(nèi)含子組成，TsM_000719200 和 TsM_000569000 編碼基因由 4 個外顯子和 3個內(nèi)含子組成（見圖 1）。表 2 豬帶絳蟲 Ts14-3-3 蛋白結(jié)構(gòu)域分析Table 2 Domain analysis of Ts14-3-3 protein of Taenia soliumDomain Start End E-value IsoformsTsM_000719200 14-3-3 7 246 5.93e-150-TsM_000804900 14-3-3 18 256 6.3e-113Zeta; DeltaTsM_000747500 14-3-3 16 248 1.43e-111Beta; AlphaTsM_000569000 14-3-3 7 249 4.24e-137EpsilonTsM_001162700 14-3-3 9 239 2.95e-31GammaTsM_000260000 14-3-3 4 255 7.26e-63-

圖 2 豬帶絳蟲 Ts14-3-3 蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig 2 Three-dimensional structure of Ts14-3-3 protein of Taenia solium3.6 Ts14-3-3 蛋白同源序列分析通過 Clustal W 軟件分析 Ts14-3-3 蛋白序列，結(jié)果顯示 6 個蛋白序列一致性為 53.38%，其中 TsM_000719200 與 TsM_000569000 相似性較高，為 54.45%，TsM_001162700 與 TsM_000260000 相似性僅為 19.93%。變異性較高的序列位于N-端和 C-端，變異程度最大的蛋白是 TsM_000260000，在其序列中部有 11 個氨基酸片段的插入（見圖 3）。

圖 2 豬帶絳蟲 Ts14-3-3 蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig 2 Three-dimensional structure of Ts14-3-3 protein of Taenia solium3.6 Ts14-3-3 蛋白同源序列分析通過 Clustal W 軟件分析 Ts14-3-3 蛋白序列，結(jié)果顯示 6 個蛋白序列一致性為 53.38%，其中 TsM_000719200 與 TsM_000569000 相似性較高，為 54.45%，TsM_001162700 與 TsM_000260000 相似性僅為 19.93%。變異性較高的序列位于N-端和 C-端，變異程度最大的蛋白是 TsM_000260000，在其序列中部有 11 個氨基酸片段的插入（見圖 3）。
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1 李想;豬帶絳蟲Ts14-3-3基因家族鑒定、表達及Ts14-3-3.3蛋白組織定位研究[D];遵義醫(yī)科大學;2019年

本文編號：2852558