本文關(guān)鍵詞：Rad1抗體的制備與ccFv抗體展示系統(tǒng)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的1使用雜交瘤技術(shù)制備小鼠DNA損傷響應(yīng)蛋白R(shí)ad1(m Rad1)抗體;利用該抗體研究Rad1的定位及DNA損傷壓力下Rad1的行為。2用卷曲螺旋異源二聚體(cc Fv)形式將抗體可變區(qū)展示在細(xì)菌內(nèi)膜表面,構(gòu)建大容量抗體突變庫(kù),利用流式精確分選對(duì)已獲得的抗體進(jìn)行親和力成熟,為抗體的人工進(jìn)化提供技術(shù)平臺(tái)。方法1 PCR擴(kuò)增小鼠Rad1并構(gòu)建到原核表達(dá)質(zhì)粒p GEX-6p-1上,利用GST層析柱純化m Rad1蛋白,并用其免疫BABL/c小鼠,使用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體;酶聯(lián)免疫吸附、蛋白質(zhì)印跡、免疫共沉淀和免疫熒光方法檢測(cè)抗體應(yīng)用性,生物大分子相互作用Surface Plasmon Resonace(SPR)測(cè)定抗體親和力;用自制抗體通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rad1在DNA合成抑制劑hydroxyurea(HU)作用下的表達(dá)情況。2雙鏈抗體表達(dá)體系質(zhì)粒的構(gòu)建,易錯(cuò)PCR突變抗體庫(kù)的構(gòu)建,在細(xì)菌內(nèi)膜上表達(dá)并展示抗體,流式細(xì)胞術(shù)分析分選,PCR回收優(yōu)勢(shì)抗體基因,抗體突變株的測(cè)序、篩選及表達(dá),SPR測(cè)定抗體親和力。結(jié)果1通過(guò)優(yōu)化的雜交瘤技術(shù)成功獲得了高質(zhì)量的小鼠Rad1單克隆抗體F10,多種生化手段顯示該抗體遠(yuǎn)優(yōu)于商業(yè)來(lái)源抗體;利用該單抗發(fā)現(xiàn):Rad1的表達(dá)受另一個(gè)DNA損傷響應(yīng)蛋白R(shí)ad9的調(diào)控。2成功的構(gòu)建了抗TNFα的抗體大容量cc Fv形式的細(xì)菌展示抗體庫(kù),利用該系統(tǒng)提高了抗體的親和力,成功的將Rad1抗體基因展示于細(xì)菌內(nèi)膜表面。結(jié)論1提高抗原純度和增加免疫動(dòng)物時(shí)間能夠提高制備的單克隆抗體的特異性和親和力。2制備的Rad1抗體F10可用于酶聯(lián)免疫吸附、蛋白質(zhì)印跡、免疫共沉淀和免疫熒光,親和力特異性高。3 Rad1的表達(dá)受Rad9調(diào)控;研究結(jié)果指出,過(guò)去建立的DNA損傷修復(fù)模型需要修改。4細(xì)菌內(nèi)膜雙鏈抗體展示系統(tǒng)能夠成功進(jìn)化抗體的親和力,流式精準(zhǔn)分選具有重要意義,該新型抗體展示平臺(tái)豐富了抗體展示平臺(tái)。
【關(guān)鍵詞】：Rad9-Rad1-Hus1(9-1-1)復(fù)合體 Rad1 卷曲螺旋異源二聚體可變區(qū)(ccFv) 抗體表面展示 親和力成熟
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-14
• 第1章 高質(zhì)量Rad1抗體的制備及Rad1的細(xì)胞定位14-33
• 1.1 材料與方法14-22
• 1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑14-17
• 1.1.2 方法17-22
• 1.2 結(jié)果22-28
• 1.2.1 高純度mRad1抗原蛋白的獲得22
• 1.2.2 Rad1單克隆抗體F10能夠識(shí)別人、鼠Rad1蛋白22-23
• 1.2.3 F10親和力的檢測(cè)23-24
• 1.2.4 F10與市售Rad1抗體的比較24
• 1.2.5 Rad1對(duì)DNA抑制劑HU的應(yīng)答24-25
• 1.2.6 內(nèi)源Rad1的細(xì)胞定位25-27
• 1.2.7 Rad1單克隆抗體的序列、亞型測(cè)定及生物信息學(xué)分析27-28
• 1.2.8 Rad1單克隆抗體的ccFv展示28
• 1.3 討論28-32
• 1.3.1 優(yōu)質(zhì)Rad1抗體的重要性28-29
• 1.3.2 單克隆抗體制備過(guò)程的優(yōu)化29
• 1.3.3 Rad1抗體F10的優(yōu)越性29
• 1.3.4 Rad1受Rad9的表達(dá)調(diào)控29-30
• 1.3.5 Rad1主要存在于MES細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中30
• 1.3.6 在HU處理下Rad1并沒(méi)有表現(xiàn)出遷移進(jìn)入細(xì)胞核的現(xiàn)象30
• 1.3.7 對(duì)不同批次抗體的生物信息學(xué)分析30-31
• 1.3.8 Rad1抗體的ccFv展示31
• 1.3.9 展望31-32
• 1.4 本章小結(jié)32-33
• 第2章 ccFv細(xì)菌內(nèi)膜抗體展示平臺(tái)的建立及應(yīng)用33-48
• 2.1 材料與方法33-40
• 2.1.1 材料33-34
• 2.1.2 方法34-40
• 2.2 結(jié)果40-46
• 2.2.1 ccFv抗體可成功展示在大腸桿菌內(nèi)膜表面40-41
• 2.2.2 ccFv抗體展示庫(kù)優(yōu)化抗體的可行性分析41-43
• 2.2.3 精確分選進(jìn)化抗體親和力及優(yōu)化的抗體序列分析43-44
• 2.2.4 精確分選的靈敏性44-46
• 2.3 討論46-48
• 2.3.1 ccFv抗體展示平臺(tái)的優(yōu)缺點(diǎn)46-47
• 2.3.2 精確分選的重要意義47
• 2.3.3 展望47-48
• 2.4 本章小結(jié)48
• 參考文獻(xiàn)48-55
• 第3章 綜述 科學(xué)研究的推動(dòng)力——抗體與抗體進(jìn)化55-79
• 3.1 9-1-1復(fù)合體與Rad1的研究進(jìn)展55-58
• 3.1.1 9-1-1蛋白簡(jiǎn)介55-57
• 3.1.2 9-1-1蛋白復(fù)合體和腫瘤的關(guān)系57
• 3.1.3 Rad1的研究進(jìn)展及其抗體的重要性57-58
• 3.2 單克隆抗體的發(fā)展58-62
• 3.2.1 單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)功能58-59
• 3.2.2 基因工程抗體59-61
• 3.2.3 抗體與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的密切關(guān)系61-62
• 3.3 ccFv細(xì)菌內(nèi)膜抗體展示平臺(tái)——新的抗體展示系統(tǒng)62-69
• 3.3.1 多種多樣的抗體展示技術(shù)63-66
• 3.3.2 細(xì)菌展示技術(shù)66-69
• 3.4 結(jié)論和展望69-70
• 參考文獻(xiàn)70-79
• 結(jié)論79-80
• 致謝80-81
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介81-82
• 作者簡(jiǎn)介82-83
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集83

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