目的:本課題前期研究證實干擾素-α(Interferon-α,IFN-α)能夠促進口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導濾泡輔助性T細胞(Follicular helper T cell,Tfh)的分化和促進生發(fā)中心的形成,從而增強小鼠的體液免疫應答。研究證實,CD4~+T細胞中存在長壽命記憶性Tfh細胞并主要負責激活IgG1型記憶B細胞,啟動適應性免疫應答。但IFN-α是否能促進記憶性Tfh細胞的產生尚不清楚。因此,本研究通過體內實驗明確IFN-α對FMD重組腺病毒疫苗誘導記憶性Tfh細胞分化及其功能的影響,初步探討IFN-α促進FMD重組腺病毒疫苗誘導記憶性Tfh細胞分化的機制,為進一步研究IFN-α調控疫苗免疫的新機制提供理論數(shù)據。方法:1.將6-8周雌性BALB/c小鼠隨機分為6組,每組20只,分別免疫腺病毒空載體(rAd)、表達FMDV VP1的重組腺病毒(rAd5VP1)、表達豬IFN-α的重組腺病毒(rAd5poIFN-α)、共表達FMDV VP1和豬IFN-α的重組腺病毒(rAd5VP1-2A-poIFN-α)、聯(lián)合免疫rAd5VP1和rAd5poIFN-α(rAd5VP1+rAd5poIFN-α)以及豬O型口蹄疫滅活疫苗(inactivited vaccine);間隔兩周免疫一次,共免疫2次。分別在初次免疫后30天、60天、90天取小鼠脾臟,密度梯度離心法收獲單個核細胞,采用流式細胞術檢測CD4~+CD44~+活化T細胞、CD4~+CD44~+CD62L~-記憶性T細胞、CD4~+CXCR5~+記憶性Tfh細胞的比例;流式細胞術檢測CD38~+B220~+記憶性B細胞、CD38~+B220~+GL-7~-IgG1~+記憶性B細胞的比例。在初次免疫后90天流式細胞術檢測Tfh細胞中趨化因子CXCR3、CCR6的表達。2.初次免疫90天后,對小鼠進行再次免疫,免疫前及免疫后3天做如下研究:2.1取小鼠脾臟,密度梯度離心法收獲單個核細胞,采用流式細胞術檢測CD4~+CD44~+活化T細胞、CD4~+CD44~+CD62L~-記憶性T細胞、CD4~+CXCR5~+記憶性Tfh細胞的比例;Tfh細胞特征性轉錄因子Bcl-6的表達;Tfh細胞分泌細胞因子IL-21、IL-4、IFN-γ的表達水平;記憶性B細胞中協(xié)同共刺激分子CD86的表達水平。2.2取小鼠脾臟,密度梯度離心法收獲單個核細胞,采用real-time PCR技術檢測Tfh細胞相關轉錄因子STAT1、Bcl-6的表達水平。2.3取小鼠眼球血,分離血清,采用ELISA檢測total IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b的分泌水平。結果:1.IFN-a促進口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導記憶性T細胞、記憶性Tfh細胞的產生。1.1小鼠免疫重組腺病毒30天后,流式細胞術檢測結果顯示:rAd5VP1+rAd5poIFN-α組和rAd5VP1-2A-poIFN-α組CD4~+CD44~+細胞的比例明顯高于rAd組,差異有統(tǒng)計學意義;rAd5VP1-2A-poIFN-α組CD4~+CD44~+細胞的比例明顯高于rAd5VP1組,差異有統(tǒng)計學意義;CD4~+CD44~+細胞數(shù)量在60天持續(xù)存在,90天之后略有下降。1.2小鼠免疫重組腺病毒30天后,rAd5VP1+rAd5poIFN-α組和rAd5VP1-2A-poIFN-α組CD4~+CD44~+CD62L~-細胞的比例明顯高于rAd組,差異有統(tǒng)計學意義;CD4~+CD44~+CD62L~-細胞數(shù)量在在60天持續(xù)存在,90天之后略有下降。1.3小鼠免疫重組腺病毒30天后,rAd5VP1+rAd5poIFN-α組和rAd5VP1-2A-poIFN-α組CD4~+CXCR5~+細胞的比例明顯高于rAd組、rAd5VP1組以及rAd5poIFN-α組,差異有統(tǒng)計學意義;rAd5VP1-2A-poIFN-α組CD4~+CXCR5~+細胞的比例明顯高于inactivited vaccine組,差異有統(tǒng)計學意義;CD4~+CXCR5~+細胞數(shù)量在在60天持續(xù)存在,90天之后略有下降。1.4小鼠免疫重組腺病毒90天后,流式細胞術檢測結果顯示:rAd5VP1-2A-poIFN-α組Th1型Tfh細胞(CXCR3~+CCR6~-)的比例明顯高于rAd組、rAd5VP1組、rAd5poIFN-α組以及inactivited vaccine組,差異有統(tǒng)計學意義;rAd5VP1+rAd5poIFN-α組Th1型Tfh細胞(CXCR3~+CCR6~-)的比例明顯高rAd組,差異有統(tǒng)計學意義。rAd5VP1+rAd5poIFN-α組Th2型Tfh細胞(CXCR3~-CCR6~-)的比例明顯高于rAd組、rAd5VP1組以及rAd5poIFN-α組,差異有統(tǒng)計學意義;rAd5VP1-2A-poIFN-α組Th2型Tfh細胞(CXCR3~-CCR6~-)的比例明顯高于rAd組和rAd5poIFN-α組,差異有統(tǒng)計學意義;各組間Th17型Tfh細胞(CXCR3~-CCR6~+)數(shù)量無明顯差異。2.IFN-a促進口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導記憶性B細胞的分化2.1小鼠免疫重組腺病毒30天后,流式細胞術檢測結果顯示:rAd5VP1+rAd5poIFN-α組、rAd5VP1-2A-poIFN-α組和inactivited vaccine組CD38~+B220~+細胞的比例明顯高于rAd組和rAd5poIFN-α組,差異有統(tǒng)計學意義;rAd5VP1組CD38~+B220~+細胞的比例明顯高于rAd組,差異有統(tǒng)計學意義;CD38~+B220~+細胞數(shù)量在60天持續(xù)存在,90天之后略有下降。2.2小鼠免疫重組腺病毒30天后,rAd5VP1-2A-poIFN-α組CD38~+B220~+GL-7~-IgG1~+細胞的比例明顯高于rAd組、rAd5VP1組和rAd5poIFN-α組,差異有統(tǒng)計學意義;rAd5VP1+rAd5poIFN-α組CD38~+B220~+GL-7~-IgG1~+細胞的比例明顯高于rAd5VP1組,差異有統(tǒng)計學意義;CD38~+B220~+GL-7~-IgG1~+細胞數(shù)量在60天持續(xù)存在,90天之后略有下降。3.小鼠再次免疫重組腺病毒對記憶性Tfh細胞以及體液免疫應答的影響3.1小鼠首次免疫后90天再次免疫重組腺病毒,3天后,流式細胞術檢測結果顯示:各組CD4~+CD44~+細胞、CD4~+CD44~+CD62L~-細胞以及CD4~+CXCR5~+細胞的比例明顯高于再免疫前,差異有統(tǒng)計學意義。3.2小鼠首次免疫后90天再次免疫重組腺病毒,3天后,流式細胞術檢測結果顯示:rAd5VP1組、rAd5VP1+rAd5poIFN-α組、rAd5VP1-2A-poIFN-α組和inactivited vaccine組Tfh細胞中IL-21的表達明顯高于再免疫前,差異有統(tǒng)計學意義;其余各組有升高趨勢,但無統(tǒng)計學差異。rAd5poIFN-α組、rAd5VP1+rAd5poIFN-α組和rAd5VP1-2A-poIFN-α組Tfh細胞中IFN-γ的表達明顯高于再免疫前,差異有統(tǒng)計學意義;其余各組有升高趨勢,但無統(tǒng)計學差異。各組Tfh細胞中IL-4的表達明顯高于再免疫前,差異有統(tǒng)計學意義。3.3小鼠首次免疫后90天再次免疫重組腺病毒,3天后,流式細胞術檢測結果顯示:rAd5VP1+rAd5poIFN-α組、rAd5VP1-2A-poIFN-α組記憶性B細胞表面協(xié)同共刺激分子CD86的表達明顯高于再免疫前,差異有統(tǒng)計學意義;其余各組有升高趨勢,但無統(tǒng)計學差異。3.4小鼠首次免疫后90天再次免疫重組腺病毒,3天后,ELISA結果顯示:各組血清中total IgG、IgG1抗體的分泌水平明顯高于再免疫前,差異有統(tǒng)計學意義;inactivited vaccine組血清中IgG2a抗體的分泌水平明顯高于再免疫前,差異有統(tǒng)計學意義;其余各組無統(tǒng)計學差異。rAd5VP1+rAd5poIFN-α組、rAd5VP1-2A-poIFN-α組和inactivited vaccine組血清中IgG2b抗體的分泌水平明顯高于再免疫前,差異有統(tǒng)計學意義;其余各組無統(tǒng)計學差異。4.IFN-a促進口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導轉錄因子Bcl-6、STAT1的表達。4.1小鼠免疫重組腺病毒90天后,流式細胞術檢測結果顯示:各組CXCR5~+T細胞中轉錄因子Bcl-6的表達均明顯高于CXCR5~-T細胞,差異有統(tǒng)計學意義。4.2小鼠首次免疫后90天再次免疫重組腺病毒,3天后,流式細胞術檢測結果顯示:rAd組、rAd5VP1組、rAd5poIFN-α組、rAd5VP1+rAd5poIFN-α組以及rAd5VP1-2A-poIFN-α組Tfh細胞(CXCR5~+Bcl-6~+)數(shù)量比例明顯高于再免疫前,差異有統(tǒng)計學意義;inactivited vaccine組Tfh細胞(CXCR5~+Bcl-6~+)數(shù)量比例有升高趨勢,但無統(tǒng)計學差異。4.3小鼠首次免疫后90天再次免疫重組腺病毒,3天后,real-time PCR檢測結果顯示:各組STAT1 mRNA的表達水平明顯高于再免疫前,差異有統(tǒng)計學意義;rAd組、rAd5VP1組、rAd5poIFN-α組、rAd5VP1+rAd5poIFN-α組以及rAd5VP1-2A-poIFN-α組Bcl-6 mRNA的表達水平明顯高于再免疫前,差異有統(tǒng)計學意義;inactivited vaccine組Bcl-6 mRNA的表達水平相比于再免疫前有升高趨勢,但無統(tǒng)計學差異。結論:IFN-α作為口蹄疫重組腺病毒疫苗的免疫調節(jié)劑,能夠增強重組腺病毒疫苗誘導記憶性T細胞、記憶性Tfh細胞、記憶性B細胞的分化,增強Tfh細胞趨化因子(CXCR3,CCR6)的表達;促進細胞因子(IL-21,IL-4,IFN-γ)及抗體的分泌;再次免疫后,IFN-α促進口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導的Tfh細胞發(fā)揮免疫功能,IFN-α可能通過提高轉錄因子STAT1的表達促進Bcl-6的表達,進而促進Tfh細胞的分化。為進一步研究IFN-α調控疫苗免疫的新機制提供理論數(shù)據。
【學位單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

寧夏醫(yī)科大學碩士學位論文 結果圖 1. 活化 T 細胞、記憶性 T 細胞、記憶性 Tfh 細胞的設門策略10.2 FCM 檢測小鼠免疫后 30 天、60 天、90 天活化 T 細胞的數(shù)量FCM 結果顯示如圖 2 ， rAd5VP1+rAd5poIFN-α 組和 rAd5VP1-2A-poIFN-α 組CD4+CD44+細胞的比例分別為 2.85%±0.14% 和 2.98%±0.33%，明顯高于 rAd 組（2.46%±0.32%），P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義；rAd5VP1-2A-poIFN-α 組 CD4+CD44+細胞的比例明顯高于 rAd5VP1 組（2.53%±0.33%），P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義；rAd5VP1+rAd5poIFN-α 組和 rAd5VP1-2A-poIFN-α 組較其余各組有升高趨勢，但無統(tǒng)計學差異�；罨� T 細胞（CD4+CD44+）數(shù)量持續(xù)存在至少 90 天以上。

寧夏醫(yī)科大學碩士學位論文 結果CD4+CD44+CD62L-細胞的比例為 10.13%±0.99%，明顯高于 rAd 組，P<0.01，差異有統(tǒng)計學意義；rAd5VP1+rAd5poIFN-α 組、Ad5VP1-2A-poIFN-α 組和 inactivited vaccine 組較其余各組有升高趨勢，但無統(tǒng)計學差異。記憶性 T 細胞（CD4+CD44+CD62L-）數(shù)量持續(xù)存在至少 90 天以上。

圖 4. FCM 檢測小鼠免疫后 30 天、60 天、90 天記憶 Tfh 性細胞的數(shù)量11. FCM 檢測再免疫前后活化 T 細胞、記憶性 T 細胞、記憶性 Tfh 細胞數(shù)量6-8 周雌性 BALB/c 小鼠隨機分為 6 組，分別免疫 rAd、rAd5VP1、rAd5poIFN-α、rAd5VP1-2A-poIFN-α、rAd5VP1+rAd5poIFN-α 以及 inactivited vaccine；間隔兩周免疫一次，共免疫 2 次。初次免疫后 90 天，分別以相同重組腺病毒再次免疫，3 天后，取小鼠脾臟，密度梯度離心法收獲單個核細胞，采用 FCM 檢測免疫前后 CD4+CD44+活化 T 細胞、CD4+CD44+CD62L-記憶性 T 細胞以及 CD4+CXCR5+記憶性 Tfh 細胞的數(shù)量。FCM 結果顯示如圖 5 ，各組 CD4+CD44+細胞、CD4+CD44+CD62L-細胞以及CD4+CXCR5+細胞的比例明顯高于再免疫前，差異有統(tǒng)計學意義。
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本文編號：2840534