目的:探討重組甲型流感病毒H1N1血凝素1(Hemagglutinin 1,rHA1)對(duì)小鼠原代氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生β-防御素(β-defensins,BD)的作用,以及基于NF-κB信號(hào)通路的作用機(jī)制。方法:培養(yǎng)小鼠原代氣管上皮細(xì)胞,細(xì)胞分組為:正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組包括:rHA1組(200ng/mL)、病毒組(2×TCID50)、滅活病毒組、rHA1+病毒組、rHA1+滅活病毒組;另設(shè)抑制組,即在相同的實(shí)驗(yàn)條件下提前1h給予NF-κB的抑制劑PDTC(Pyrrolidine dithiocarbama,吡咯烷二硫基甲酸鹽,PDTC)20μM,再分別加入各組制劑。分別作用細(xì)胞4h、8h、24h后,HE(Hematoxylin-Eosin staining,蘇木精-伊紅染色法,HE)染色觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;收集細(xì)胞,提取細(xì)胞內(nèi)容物、蛋白質(zhì)和RNA,通過(guò)qRT-PCR、Western blot和ELISA方法檢測(cè)各組mBD2~4、IFN-γ、NF-κBp65、NF-κB P-p65、NF-κBp50、NF-κB P-p50、NF-κB IκB、NF-κB P-IκB各指標(biāo)的基因和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1.HE染色結(jié)果顯示:作用4h、8h、24h后,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與正常組細(xì)胞相比,細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大小不一的空泡、部分細(xì)胞核固縮及合胞體等細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。2.qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與正常組細(xì)胞相比,Mbd2~4、IFN-γ、NF-κB p65/p50基因表達(dá)上調(diào),rHA1+病毒組與病毒組相比,Mbd2~4、IFN-γ、NF-κB p65/p50基因表達(dá)上調(diào),rHA1+滅活病毒組與滅活病毒組相比,Mbd2~4、IFN-γ、NF-κB p65/p50基因表達(dá)上調(diào)。PDTC(20μM)作用細(xì)胞后,與未加抑制劑的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組比較,Mbd2~4、IFN-γ基因表達(dá)下調(diào),rHA1+病毒組與病毒組相比Mbd2~4、IFN-γ基因表達(dá)下調(diào),rHA1+滅活病毒組與滅活病毒組相比Mbd2~4、IFN-γ基因表達(dá)下調(diào)。3.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與正常組細(xì)胞相比,IFN-γ、NF-κB IκB、NF-κB p65/p50蛋白表達(dá)上調(diào),rHA1+病毒組與病毒組相比,IFN-γ、NF-κB IκB、NF-κB p65/p50蛋白表達(dá)上調(diào),rHA1+滅活病毒組與滅活病毒組相比,IFN-γ、NF-κB IκB、NF-κB p65/p50蛋白表達(dá)上調(diào)。PDTC(20μM)作用細(xì)胞后,與未加抑制劑的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組比較,rHA1+病毒組與病毒組相比,IFN-γ蛋白表達(dá)下調(diào),rHA1+滅活病毒組與滅活病毒組相比,IFN-γ蛋白表達(dá)下調(diào)。4.ELISA結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與正常組細(xì)胞相比,mBD2~4蛋白表達(dá)上調(diào),rHA1+病毒組與病毒組相比,mBD2~4蛋白表達(dá)上調(diào),rHA1+滅活病毒組與滅活病毒組相比,mBD2~4蛋白表達(dá)上調(diào)。PDTC(20μM)作用細(xì)胞后,與未加抑制劑的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組比較,mBD2~4蛋白表達(dá)下調(diào),r HA1+病毒組與病毒組相比,mBD2~4蛋白表達(dá)下調(diào),rHA1+滅活病毒組與滅活病毒組相比,mBD2~4蛋白表達(dá)下調(diào)。結(jié)論:1.甲型流感病毒重組rHA1能夠單獨(dú)或協(xié)同活的/滅活流感病毒誘導(dǎo)mBD2~4、IFN-γ的表達(dá)作用。2.甲型流感病毒rHA1單獨(dú)或活的/滅活流感病毒誘導(dǎo)小鼠氣管上皮細(xì)胞mBD2~4、IFN-γ的表達(dá)上調(diào)作用與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。
【學(xué)位單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R373
【部分圖文】：

19圖 2-1 流感病毒 rHA1 作用小鼠氣管上皮細(xì)胞的 HE 染色結(jié)果（400×）Fig.2-1 The HE staining of Influenza virus rHA1 on mouse tracheal epithelial cell.圖注：HA1 組（HA1），HA1+病毒組（HA1+IAV），病毒組（IAV），HA1+滅活病毒組（HA1+I），滅活病毒組（I），正常組（C）。黑色箭頭表示：細(xì)胞變性變化2.3 流感病毒 rHA1 對(duì)小鼠氣管上皮細(xì)胞基因檢測(cè)指標(biāo)表達(dá)的影響rHA1 組、病毒組、滅活病毒組、rHA1+病毒組、rHA1+滅活病毒組、正常對(duì)照組。分別作用于 4h、8h、24h 其表達(dá)情況如下：2.3.1 Mbd2 檢測(cè)結(jié)果:如圖 3-1A 所示 4h rHA1 組與正常組比較 Mbd2（t 值-163.0,P<0.05）基因誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，rHA1+病毒組與病毒組比較誘導(dǎo) Mbd2（t 值-46.063,P<0.05）表達(dá)上調(diào)，rHA1+滅活病毒組與滅活病毒組比較誘導(dǎo) Mbd2（t 值-21.913,P<0.05）表達(dá)上調(diào)。如圖 3-1 B 所示 8h rHA1 組比正常組的 Mbd2（t 值-545.0,P<0.05）基因
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2840282