目的:構(gòu)建帶有增強型熒光蛋白(EGFP)標記的針對大鼠Slfn1(Schlafen1,睡眠因子1)的shRNA(發(fā)夾狀RNA)干擾載體,并進行腺病毒包裝,將其轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)48h后,觀察Slfn1的沉默表達對VSMCs增殖的影響。方法:1、根據(jù)Rat Slfn1基因的轉(zhuǎn)錄本設(shè)計并合成3個干擾RNA靶點shRNA-Slfn1(1)、shRNA-Slfn1(2)、shRNA-Slfn1(3)和1個陰性對照序列NC-shRNA,并將單鏈的引物退火成雙鏈oligo序列,連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體(pDKD-CMV-U6-shRNA)的U6啟動子下游,替換掉原來的ccdB基因;經(jīng)菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子,其陽性克隆進行測序驗證,將正確的克隆進行高純度質(zhì)粒抽提;利用Admax系統(tǒng),將3種目的穿梭質(zhì)粒、1種陰性對照穿梭質(zhì)粒分別與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中重組獲得病毒后進行小量擴增及病毒滴度測定;利用Slfn1過表達腺病毒質(zhì)粒中目的基因攜帶Flag標簽,通過Western Blot檢測Slfn1過表達腺病毒質(zhì)粒與靶點質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞中Flag的表達,觀察靶點質(zhì)粒對Slfn1表達的影響。2、通過組織塊貼壁法原代培養(yǎng)VSMCs,應(yīng)用倒置相差顯微鏡對不同培養(yǎng)時間的細胞進行形態(tài)學(xué)觀察,使用免疫熒光法對培養(yǎng)細胞進行鑒定。3、使用最適感染復(fù)數(shù)的shRNA-Slfn1(1)重組腺病毒轉(zhuǎn)染VSMCs 48h后,應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察EGFP的表達情況,并使用流式細胞儀檢測其轉(zhuǎn)染效率,通過PCR檢測Slfn1 mRNA的表達,最后使用CCK-8檢測Slfn1的沉默表達對VSMCs增殖的影響。結(jié)果:1、經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽性克隆并進行測序驗證正確,表明構(gòu)建質(zhì)粒成功;經(jīng)腺病毒包裝及病毒擴增與純化后,shRNA-Slfn1(1)、shRNA-Slfn1(2)、shRNA-Slfn1(3)及NC-shRNA的病毒滴度分別為1.0x1011 ifu/ml,2.5x1011 ifu/ml,6.3x1010 ifu/ml,5.5x1010 ifu/ml。Western Blot證實shRNA-Slfn1(1)和shRNA-Slfn1(3)能顯著降低293T細胞中Flag的表達,確定shRNA-Slfn1(1)及shRNA-Slfn1(3)為目的質(zhì)粒。2、原代培養(yǎng)第4-6天時,部分組織塊周圍開始有長梭形細胞爬出;第7-9天時,組織塊周圍細胞爬出較少的呈網(wǎng)狀生長,細胞爬出較多的呈漩渦狀生長,致密排列呈束狀;第10-14天時,細胞呈放射狀、典型的“峰—谷”樣結(jié)構(gòu),相互融合達80%左右即可傳代,此時傳代細胞相比原代細胞生長速度明顯加快,細胞變大,折光性減弱。免疫熒光染色鑒定可見VSMCs特異性的α-平滑肌肌動蛋白(α-SM-actin)表達,表達的陽性細胞數(shù)在95%以上。3、shRNA-Slfn1(1)重組腺病毒轉(zhuǎn)染VSMCs48h后,倒置熒光顯微鏡下的EGFP、流式細胞儀檢測的轉(zhuǎn)染效率均達80%以上;PCR結(jié)果顯示:Slfn1干擾組與Slfn1干擾對照組相比,Slfn1 mRNA表達量明顯減少;CCK-8結(jié)果顯示:使用shRNA-Slfn1重組腺病毒載體降低VSMCs中Slfn1基因的表達后,與對照組相比促進VSMCs的增殖。結(jié)論:1、成功構(gòu)建了大鼠shRNA-Slfn1的重組腺病毒載體。2、shRNA-Slfn1(1)重組腺病毒對原代大鼠VSMCs具有干擾作用且干擾效率較高,干擾VSMCs中Slfn1基因的表達促進VSMCs的增殖。
【學(xué)位單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：Q78;R329.2
【部分圖文】：

圖 1-1 穿梭質(zhì)粒圖譜Fig. 1-1 Map of Shuttle plasmidAgeI 和 EcoRI 酶酶切 U6 啟動子下游的 ccdB 毒性基因，酶

對照（空載體質(zhì)粒）；2 為 DNAMarker,從上到下的方向依次為 2 000 100 bp；3~10 為挑取的 8 個轉(zhuǎn)化子。圖 2-2 菌落 PCR 鑒定陽性克隆Fig. 2-2 Bacterial colonies were identified by PCR.

Fig. 2-2 Bacterial colonies were identified by PCR.2.2.2 測序鑒定重組穿梭質(zhì)粒挑取陽性克隆進行測序驗證，通過 Chromas 測序軟件分析顯示所插入的 3對 shRNA 及 1 對對照序列與設(shè)計序列完全一致，表明目的穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功：
【參考文獻】

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本文編號：2839951