目的:精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells,精原干細(xì)胞)既可分化為成熟精子細(xì)胞,也可自我更新保持干細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定,對(duì)男性生育力維持有重要的作用。精原干細(xì)胞是人體內(nèi)唯一可以將遺傳物質(zhì)傳遞給子代的成體干細(xì)胞,在生殖醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)有重要的應(yīng)用前景。由于環(huán)境因素、不良生活方式、感染、遺傳因素等交互影響,不育癥已成為嚴(yán)重影響人類生殖與人口健康的重大疾病。在世界范圍內(nèi),不孕不育約占育齡夫婦的15%,其中,由男性因素引起的不育癥約占一半。非梗阻性無精子癥無有效的治療方法,其發(fā)病機(jī)制不清楚。據(jù)報(bào)道,人精原干細(xì)胞在非梗阻性無精子癥(NOA)患者比梗阻性無精子癥(OA)人群數(shù)目顯著減少,且體外培養(yǎng)過程中NOA患者的精原干細(xì)胞增殖減慢,表明人精原干細(xì)胞增殖、凋亡的異常參與非梗阻性無精子癥的致病機(jī)制。由于人類精原干細(xì)胞的來源有限,原代精原干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)困難,人類精原干細(xì)胞自我更新調(diào)控的分子機(jī)制未見報(bào)道。因此,我們首次發(fā)現(xiàn)了人精原干細(xì)胞中PAK1在生長因子刺激下表達(dá)升高,并研究了PAK1在人精原干細(xì)胞的表達(dá)及其對(duì)人精原干細(xì)胞自我更新與凋亡的作用及其調(diào)控的分子機(jī)制。并且,我們比較了NOA和OA人群中的表達(dá)水平。本學(xué)位論文將為人類精原干細(xì)胞的命運(yùn)決定提供新的遺傳與表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。方法:通過RT-PCR、Western blots、免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)對(duì)人精原干細(xì)胞系進(jìn)行鑒定和純度檢測(cè)。免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)PAK1在人精原干細(xì)胞系和人類生精小管的表達(dá)。生長因子處理后,我們運(yùn)用real-time PCR和Western blots檢測(cè)了PAK1的表達(dá);為了確定調(diào)控PAK1表達(dá)變化的生長因子,我們培養(yǎng)基中添加了生長因子濃度為10 ng/ml GDNF、10 ng/ml FGF2或者10 ng/ml EGF、以及聯(lián)合三種生長因子,并進(jìn)行PAK1表達(dá)水平的檢測(cè)。PAK1-si RNAs轉(zhuǎn)染后,在RNA和蛋白水平確認(rèn)敲低效果后,進(jìn)行CCK8、PCNA水平、Brd U攝入、流式細(xì)胞凋亡等實(shí)驗(yàn),檢測(cè)PAK1對(duì)人精原干細(xì)胞系的增殖和凋亡的影響。裸鼠腹腔注射白消安,去除其睪丸組織內(nèi)的生殖細(xì)胞后,進(jìn)行人精原干細(xì)胞系的移植實(shí)驗(yàn)。移植一個(gè)月后,裸鼠睪丸組織切片,并進(jìn)行PLZF、PCNA、Ki67、UCHL1等蛋白的免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色,在動(dòng)物體內(nèi)和整體水平研究PAK1對(duì)精原干細(xì)胞系的影響。Western blots檢測(cè)PAK1調(diào)控人類精原干細(xì)胞的ERK1/2和AKT信號(hào)通路的改變和細(xì)胞周期蛋白的變化。免疫共沉淀檢測(cè)PAK1和PDK1的相互作用。RNA-seq尋找PAK1的下游靶基因,通過生物信息學(xué)分析結(jié)合real-time PCR驗(yàn)證,選取具有重要生物學(xué)意義的下游基因。通過CCK8和流式細(xì)胞技術(shù)等檢測(cè)PAK1的靶基因調(diào)控人精原干細(xì)胞系的生物學(xué)功能。mi RNA芯片檢測(cè)PAK1敲低后非編碼小RNA(mi RNA)的變化,研究PAK1調(diào)控人精原干細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。此外,real-time PCR、Western blots和組織芯片對(duì)NOA和OA人群中PAK1的m RNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行比較。本學(xué)位論文采用Graph Pad prism5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩組之間的分析采用t檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)之間的分析采用單因素方差分析(ANOVA),p0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。結(jié)果:RT-PCR、Western blots、免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,人精原干細(xì)胞系表達(dá)原代人精原干細(xì)胞的多種分子標(biāo)記。生長因子EGF作用下,PAK1的表達(dá)水平升高,而GDNF或FGF2不改變PAK1的表達(dá)水平。PAK1敲低后,CCK8、PCNA檢測(cè)、Brd U攝入和流式細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)表明,PAK1可以促進(jìn)人類精原干細(xì)胞系DNA合成和增殖,抑制其凋亡。人精原干細(xì)胞系移植實(shí)驗(yàn)顯示,在體內(nèi)和整體水平,PAK1可以促進(jìn)精原干細(xì)胞系增殖,抑制其凋亡發(fā)生率。RNA測(cè)序表明,PAK1敲低后,與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的PDK1、ZNF367和KDR的表達(dá)水平顯著降低。免疫共沉淀結(jié)果表明PAK1可以與PDK1相互作用;ZNF367敲低后,PDK1和KDR m RNA表達(dá)水平發(fā)生降低。PDK1-,KDR-和ZNF367-si RNAs轉(zhuǎn)染后,人精原干細(xì)胞系增殖受到抑制,細(xì)胞凋亡發(fā)生率增加;另外,PAK1敲低后,我們發(fā)現(xiàn)phos-ERK1/2,phos-AKT和cyclin A的蛋白水平降低。芯片檢測(cè),PAK1敲低后,人精原干細(xì)胞系mi RNA表達(dá)的變化,發(fā)現(xiàn)mi R-31-5p顯著升高,生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其靶標(biāo),并經(jīng)過mi R-31-5p mimics和inhibitor結(jié)合q PCR驗(yàn)證,結(jié)果表明JAZF是其主要靶標(biāo)。Real-time PCR、Western blots和組織芯片結(jié)果表明,與梗阻性無精子在癥人群相比,PAK1的m RNA和蛋白表達(dá)水平在非梗阻性無精子在癥人群中表達(dá)降低。結(jié)論:人精原干細(xì)胞系表達(dá)原代人精原干細(xì)胞多個(gè)分子標(biāo)記,該細(xì)胞系純度好,可以用于人精原干細(xì)胞自我更新與凋亡的分子調(diào)控研究。我們發(fā)現(xiàn),PAK1主要受EGF調(diào)控,而不受GDNF或FGF2的影響。PAK1可以體外促進(jìn)人精原干細(xì)胞系DNA合成和增殖,抑制其凋亡。PAK1可體內(nèi)促進(jìn)人精原干細(xì)胞系在白消安處理后的小鼠的生精子小管內(nèi)定居、增殖,并抑制其發(fā)生凋亡。PAK1主要通過ERK1/2和AKT通路影響PDK1/KDR/ZNF367等下游基因而發(fā)揮功能,PAK1調(diào)控人精原干細(xì)胞系mi R-31-5p的表達(dá)。本學(xué)位論文揭示了PAK1在人精原干細(xì)胞系增殖與凋亡的作用與分子機(jī)制,及其在NOA患者中的異常表達(dá),為男性不育的發(fā)生機(jī)制和人精原干細(xì)胞在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供新的遺傳與表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R321.1
【部分圖文】：

54圖 4. PAK1 敲低后人精原干細(xì)胞系在異體移植裸鼠中存活減少、增殖減慢、凋亡比例增加。(A-F)免疫組織化學(xué)分析 PAK1 敲低后人精原干細(xì)胞系移植的裸鼠睪丸組織中 UCHL1、PLZF、PCNA、Ki67 和 TUNEL 表達(dá)。A-E 中標(biāo)尺為 10 μm。 *表示與對(duì)照 siRNA 組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文差異表達(dá)基因，包括 PDK1、KDR、ZNF367、GPX3、OIP5、THAP10、DBP 和TET1，在 PAK1 敲低后其表達(dá)水平下調(diào)(圖 5-E)，該結(jié)果與 RNA 測(cè)序結(jié)果(表 7)相一致，證明 RNA 測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可信。

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文THAP10 THAP domain containing 10 0.335 0.001493DBP albumin D-box binding protein 0.424 0.001132TET1 tet methylcytosine dioxygenase 1 0.5 0.000088
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