目的:精原干細胞(Spermatogonial stem cells,精原干細胞)既可分化為成熟精子細胞,也可自我更新保持干細胞數(shù)量的穩(wěn)定,對男性生育力維持有重要的作用。精原干細胞是人體內(nèi)唯一可以將遺傳物質(zhì)傳遞給子代的成體干細胞,在生殖醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)有重要的應(yīng)用前景。由于環(huán)境因素、不良生活方式、感染、遺傳因素等交互影響,不育癥已成為嚴重影響人類生殖與人口健康的重大疾病。在世界范圍內(nèi),不孕不育約占育齡夫婦的15%,其中,由男性因素引起的不育癥約占一半。非梗阻性無精子癥無有效的治療方法,其發(fā)病機制不清楚。據(jù)報道,人精原干細胞在非梗阻性無精子癥(NOA)患者比梗阻性無精子癥(OA)人群數(shù)目顯著減少,且體外培養(yǎng)過程中NOA患者的精原干細胞增殖減慢,表明人精原干細胞增殖、凋亡的異常參與非梗阻性無精子癥的致病機制。由于人類精原干細胞的來源有限,原代精原干細胞體外長期培養(yǎng)困難,人類精原干細胞自我更新調(diào)控的分子機制未見報道。因此,我們首次發(fā)現(xiàn)了人精原干細胞中PAK1在生長因子刺激下表達升高,并研究了PAK1在人精原干細胞的表達及其對人精原干細胞自我更新與凋亡的作用及其調(diào)控的分子機制。并且,我們比較了NOA和OA人群中的表達水平。本學(xué)位論文將為人類精原干細胞的命運決定提供新的遺傳與表觀遺傳調(diào)控機制。方法:通過RT-PCR、Western blots、免疫細胞化學(xué)等技術(shù)對人精原干細胞系進行鑒定和純度檢測。免疫細胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測PAK1在人精原干細胞系和人類生精小管的表達。生長因子處理后,我們運用real-time PCR和Western blots檢測了PAK1的表達;為了確定調(diào)控PAK1表達變化的生長因子,我們培養(yǎng)基中添加了生長因子濃度為10 ng/ml GDNF、10 ng/ml FGF2或者10 ng/ml EGF、以及聯(lián)合三種生長因子,并進行PAK1表達水平的檢測。PAK1-si RNAs轉(zhuǎn)染后,在RNA和蛋白水平確認敲低效果后,進行CCK8、PCNA水平、Brd U攝入、流式細胞凋亡等實驗,檢測PAK1對人精原干細胞系的增殖和凋亡的影響。裸鼠腹腔注射白消安,去除其睪丸組織內(nèi)的生殖細胞后,進行人精原干細胞系的移植實驗。移植一個月后,裸鼠睪丸組織切片,并進行PLZF、PCNA、Ki67、UCHL1等蛋白的免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色,在動物體內(nèi)和整體水平研究PAK1對精原干細胞系的影響。Western blots檢測PAK1調(diào)控人類精原干細胞的ERK1/2和AKT信號通路的改變和細胞周期蛋白的變化。免疫共沉淀檢測PAK1和PDK1的相互作用。RNA-seq尋找PAK1的下游靶基因,通過生物信息學(xué)分析結(jié)合real-time PCR驗證,選取具有重要生物學(xué)意義的下游基因。通過CCK8和流式細胞技術(shù)等檢測PAK1的靶基因調(diào)控人精原干細胞系的生物學(xué)功能。mi RNA芯片檢測PAK1敲低后非編碼小RNA(mi RNA)的變化,研究PAK1調(diào)控人精原干細胞的表觀遺傳學(xué)機制。此外,real-time PCR、Western blots和組織芯片對NOA和OA人群中PAK1的m RNA和蛋白表達水平進行比較。本學(xué)位論文采用Graph Pad prism5.0進行數(shù)據(jù)分析,兩組之間的分析采用t檢驗,多組數(shù)據(jù)之間的分析采用單因素方差分析(ANOVA),p0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異顯著。結(jié)果:RT-PCR、Western blots、免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,人精原干細胞系表達原代人精原干細胞的多種分子標記。生長因子EGF作用下,PAK1的表達水平升高,而GDNF或FGF2不改變PAK1的表達水平。PAK1敲低后,CCK8、PCNA檢測、Brd U攝入和流式細胞等實驗表明,PAK1可以促進人類精原干細胞系DNA合成和增殖,抑制其凋亡。人精原干細胞系移植實驗顯示,在體內(nèi)和整體水平,PAK1可以促進精原干細胞系增殖,抑制其凋亡發(fā)生率。RNA測序表明,PAK1敲低后,與細胞增殖密切相關(guān)的PDK1、ZNF367和KDR的表達水平顯著降低。免疫共沉淀結(jié)果表明PAK1可以與PDK1相互作用;ZNF367敲低后,PDK1和KDR m RNA表達水平發(fā)生降低。PDK1-,KDR-和ZNF367-si RNAs轉(zhuǎn)染后,人精原干細胞系增殖受到抑制,細胞凋亡發(fā)生率增加;另外,PAK1敲低后,我們發(fā)現(xiàn)phos-ERK1/2,phos-AKT和cyclin A的蛋白水平降低。芯片檢測,PAK1敲低后,人精原干細胞系mi RNA表達的變化,發(fā)現(xiàn)mi R-31-5p顯著升高,生物信息學(xué)預(yù)測其靶標,并經(jīng)過mi R-31-5p mimics和inhibitor結(jié)合q PCR驗證,結(jié)果表明JAZF是其主要靶標。Real-time PCR、Western blots和組織芯片結(jié)果表明,與梗阻性無精子在癥人群相比,PAK1的m RNA和蛋白表達水平在非梗阻性無精子在癥人群中表達降低。結(jié)論:人精原干細胞系表達原代人精原干細胞多個分子標記,該細胞系純度好,可以用于人精原干細胞自我更新與凋亡的分子調(diào)控研究。我們發(fā)現(xiàn),PAK1主要受EGF調(diào)控,而不受GDNF或FGF2的影響。PAK1可以體外促進人精原干細胞系DNA合成和增殖,抑制其凋亡。PAK1可體內(nèi)促進人精原干細胞系在白消安處理后的小鼠的生精子小管內(nèi)定居、增殖,并抑制其發(fā)生凋亡。PAK1主要通過ERK1/2和AKT通路影響PDK1/KDR/ZNF367等下游基因而發(fā)揮功能,PAK1調(diào)控人精原干細胞系mi R-31-5p的表達。本學(xué)位論文揭示了PAK1在人精原干細胞系增殖與凋亡的作用與分子機制,及其在NOA患者中的異常表達,為男性不育的發(fā)生機制和人精原干細胞在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供新的遺傳與表觀遺傳調(diào)控機制。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R321.1
【部分圖文】：

54圖 4. PAK1 敲低后人精原干細胞系在異體移植裸鼠中存活減少、增殖減慢、凋亡比例增加。(A-F)免疫組織化學(xué)分析 PAK1 敲低后人精原干細胞系移植的裸鼠睪丸組織中 UCHL1、PLZF、PCNA、Ki67 和 TUNEL 表達。A-E 中標尺為 10 μm。 *表示與對照 siRNA 組比有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)。

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文差異表達基因，包括 PDK1、KDR、ZNF367、GPX3、OIP5、THAP10、DBP 和TET1，在 PAK1 敲低后其表達水平下調(diào)(圖 5-E)，該結(jié)果與 RNA 測序結(jié)果(表 7)相一致，證明 RNA 測序結(jié)果準確可信。

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文THAP10 THAP domain containing 10 0.335 0.001493DBP albumin D-box binding protein 0.424 0.001132TET1 tet methylcytosine dioxygenase 1 0.5 0.000088
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本文編號：2839124