【摘要】：目的沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是革蘭染色陰性的特殊細菌,感染細胞后能在宿主細胞的胞漿內(nèi)形成包涵體,并通過包涵體膜從宿主細胞獲取營養(yǎng)物質(zhì)以完成自身的發(fā)育周期。CT036蛋白是Ct基因組編碼的假定功能蛋白,計算機軟件預測顯示其可能定位于包涵體膜,但其具體定位及生物學功能還不清楚。本實驗采用原核表達載體構建了pET28a-ct036的重組表達質(zhì)粒,在大腸桿菌中誘導His-CT036重組蛋白的表達并進行純化,免疫小鼠后制備多克隆抗體,對沙眼衣原體感染宿主細胞后CT036蛋白的表達進行定位;同時,構建了CT036慢病毒載體和對照載體,感染HeLa細胞制備CT036基因穩(wěn)定過表達細胞系與對照細胞系,并利用磷酸化蛋白質(zhì)組學技術分析了CT036細胞內(nèi)表達可能影響的細胞通路及生物學功能;最后采用Western Blot和流式細胞術等對蛋白質(zhì)組學篩查結(jié)果進行了初步驗證。該研究為揭示沙眼衣原體CT036蛋白的定位及功能提供了重要的實驗數(shù)據(jù),也為進一步深入研究沙眼衣原體的致病機制奠定了基礎。方法1.依據(jù)GenBank中CT036的基因序列設計特異性PCR引物,以Ct D型基因組為模板進行PCR擴增CT036基因。構建表達重組質(zhì)粒pET28a-ct036,鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,使用IPTG誘導表達,用SDS-PAGE和Western blot鑒定,用His-瓊脂糖樹脂純化重組蛋白,BCA法檢測重組蛋白濃度。2.用純化的pET28a-ct036重組蛋白免疫BALB/c小鼠,使用間接ELISA法檢測免疫鼠的多克隆抗體效價,Western blot檢測抗體的特異性。3.Ct D型感染HeLa細胞,以兔抗衣原體菌體及鼠抗CT036蛋白為一抗,間接免疫熒光法檢測CT036蛋白在衣原體感染細胞的定位。4.構建CT036慢病毒表達載體,與輔助包裝原件載體共同包裝慢病毒并測定慢病毒滴度,隨后用CT036慢病毒與Flag標簽對照慢病毒感染HeLa細胞。Western blotting檢測CT036蛋白的表達。5.使用磷酸化iTRAQ相對定量蛋白質(zhì)組學鑒定CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞組與對照組的差異磷酸化蛋白。Motif-x軟件對鑒定到的所有磷酸化修飾位點進行保守motif分析;對差異表達磷酸化肽段對應的蛋白進行篩選,使用GO、KEGG等生物信息學工具分析,篩選獲得CT036胞內(nèi)表達主要影響的磷酸化蛋白以及細胞通路和功能并進行體外驗證。6.將CT036蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞與慢病毒感染對照細胞進行Hoechst染色,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,WB檢測Bax和Bcl-2蛋白表達水平。7.將CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞,對照組細胞與PI3K抑制劑處理過的CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞經(jīng)TNF-α(20ng/ml)與CHX(2μg/ml)誘導凋亡6h后,使用Hoechst染色,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,WB檢測GSK 3β蛋白的磷酸化水平,WB檢測Bax和Bcl-2蛋白表達水平。結(jié)果1.成功擴增目的基因片段與重組表達質(zhì)粒載體pET28a-ct036,IPTG誘導表達后His-瓊脂糖樹脂純化出高濃度的His-CT036重組蛋白。2.pET28a-ct036重組蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫4次后產(chǎn)生高效價抗體,經(jīng)ELISA與WB檢測多克隆抗體能識別His-CT036重組蛋白,且效價≥1:52000。3.IFA結(jié)果顯示假定功能蛋白CT036在感染細胞中的分布與已知的包涵體膜蛋白IncA的分布一致,表明CT036蛋白定位于衣原體感染細胞的包涵體膜。4.成功構建了CT036慢病毒表達載體,慢病毒包裝完成后,測定慢病毒滴度較高,CT036慢病毒與Flag標簽對照慢病毒感染HeLa細胞獲得了相應的穩(wěn)定過表達細胞系,倒置熒光顯微鏡觀察有明亮的綠色熒光,Western blot檢測有目的條帶。5.磷酸化iTRAQ相對定量蛋白質(zhì)組學鑒定CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞組與對照組的差異磷酸化蛋白,共鑒定到磷酸化蛋白質(zhì)3001個、磷酸化肽段7668個。按照表達倍數(shù)變化1.2倍以上且P value0.05的標準篩選得到388個差異表達磷酸化肽段,對應301個蛋白。對這些蛋白進行GO功能富集,可知CT036蛋白主要參與調(diào)控了細胞周期、細胞凋亡、免疫進程、囊泡運輸?shù)榷喾N生物學過程。將篩選得到的53個參與調(diào)亡過程的蛋白和KEGG通路分析富集到的與凋亡相關的PI3K、mTOR、Chemokine等信號通路的蛋白取交集,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSK3β參與多條信號通路。WB檢測結(jié)果顯示CT036蛋白內(nèi)源性表達組與對照組相比GSK3β蛋白磷酸化水平明顯上升。6.Hoechst染色結(jié)果顯示:CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞組凋亡率較陽性對照組降低4.27%(P0.001);流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞組凋亡率較陽性對照組降低4.58%(P0.001)。WB檢測結(jié)果顯示CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞組與對照組相比Bax表達明顯下調(diào),Bcl-2表達明顯上調(diào)。7.經(jīng)誘導凋亡處理后,Hoechst染色結(jié)果顯示:CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞組凋亡率較陽性對照組降低21.57%(P0.0001),較CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的PI3K抑制劑處理組降低23.47%(P0.0001);流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞組凋亡率較陽性對照組降低21.19%(P0.0001),較CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的PI3K抑制劑處理組降低21.84%(P0.0001);WB檢測結(jié)果顯示CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞組與對照組相比GSK 3β發(fā)生明顯磷酸化,Bax表達明顯下調(diào),Bcl-2表達明顯上調(diào),與CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的PI3K抑制劑處理組相比GSK3β發(fā)生明顯磷酸化,Bax表達明顯下調(diào),Bcl-2表達明顯上調(diào)。結(jié)論1.沙眼衣原體假定功能蛋白CT036定位于衣原體感染細胞的包涵體膜。2.CT036的細胞內(nèi)表達影響的差異磷酸化肽段所對應的301個蛋白質(zhì)與衣原體感染相關的主要功能可能有調(diào)控細胞周期、細胞凋亡、免疫進程、囊泡運輸及內(nèi)吞等。3.CT036可能通過促進PI3K-Akt信號通路的GSK3β蛋白磷酸化而抑制細胞凋亡。
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R374
【圖文】：

圖 4.1 CT0366 基因的 PCR 電泳圖Fig. 4.1 PCR electropherogram of ct036 geneM：DNA Marke;1;: PCR amplification product of ct0.1.2 重組基因表達菌 PCR 擴增結(jié)果

圖 4.2 PCR 擴增 CT036 轉(zhuǎn)化 E.coli BL2 菌的電泳結(jié)果Fig. 4.2 PCR electropherogram of CT036 transformed E.coli BL21 strainsM：DNA Marker；1-5：BL21 PCR amplification results

圖 4.4 CT036 重組蛋白的純化Fig. 4.4 Purification map of CT036 recombinant proteinM：Protein marker；FT：Flow through；1-3：Washes；4-6：Elutions 動物免疫重組蛋白與重組蛋白的鑒定.1 重組蛋白免疫小鼠血清抗體效價分析以 450nm 相對吸光度值＞2.1 為陽性反應。結(jié)果表明重組蛋白能夠刺激小免疫反應，第四次免疫后血清抗體滴度≥1：52000。.2.重組蛋白 Western Blot 鑒定

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