【摘要】：目的沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是革蘭染色陰性的特殊細(xì)菌,感染細(xì)胞后能在宿主細(xì)胞的胞漿內(nèi)形成包涵體,并通過(guò)包涵體膜從宿主細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以完成自身的發(fā)育周期。CT036蛋白是Ct基因組編碼的假定功能蛋白,計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)顯示其可能定位于包涵體膜,但其具體定位及生物學(xué)功能還不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用原核表達(dá)載體構(gòu)建了pET28a-ct036的重組表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿菌中誘導(dǎo)His-CT036重組蛋白的表達(dá)并進(jìn)行純化,免疫小鼠后制備多克隆抗體,對(duì)沙眼衣原體感染宿主細(xì)胞后CT036蛋白的表達(dá)進(jìn)行定位;同時(shí),構(gòu)建了CT036慢病毒載體和對(duì)照載體,感染HeLa細(xì)胞制備CT036基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系與對(duì)照細(xì)胞系,并利用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了CT036細(xì)胞內(nèi)表達(dá)可能影響的細(xì)胞通路及生物學(xué)功能;最后采用Western Blot和流式細(xì)胞術(shù)等對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)篩查結(jié)果進(jìn)行了初步驗(yàn)證。該研究為揭示沙眼衣原體CT036蛋白的定位及功能提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),也為進(jìn)一步深入研究沙眼衣原體的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。方法1.依據(jù)GenBank中CT036的基因序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物,以Ct D型基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增CT036基因。構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-ct036,鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),用SDS-PAGE和Western blot鑒定,用His-瓊脂糖樹(shù)脂純化重組蛋白,BCA法檢測(cè)重組蛋白濃度。2.用純化的pET28a-ct036重組蛋白免疫BALB/c小鼠,使用間接ELISA法檢測(cè)免疫鼠的多克隆抗體效價(jià),Western blot檢測(cè)抗體的特異性。3.Ct D型感染HeLa細(xì)胞,以兔抗衣原體菌體及鼠抗CT036蛋白為一抗,間接免疫熒光法檢測(cè)CT036蛋白在衣原體感染細(xì)胞的定位。4.構(gòu)建CT036慢病毒表達(dá)載體,與輔助包裝原件載體共同包裝慢病毒并測(cè)定慢病毒滴度,隨后用CT036慢病毒與Flag標(biāo)簽對(duì)照慢病毒感染HeLa細(xì)胞。Western blotting檢測(cè)CT036蛋白的表達(dá)。5.使用磷酸化iTRAQ相對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組與對(duì)照組的差異磷酸化蛋白。Motif-x軟件對(duì)鑒定到的所有磷酸化修飾位點(diǎn)進(jìn)行保守motif分析;對(duì)差異表達(dá)磷酸化肽段對(duì)應(yīng)的蛋白進(jìn)行篩選,使用GO、KEGG等生物信息學(xué)工具分析,篩選獲得CT036胞內(nèi)表達(dá)主要影響的磷酸化蛋白以及細(xì)胞通路和功能并進(jìn)行體外驗(yàn)證。6.將CT036蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞與慢病毒感染對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行Hoechst染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,WB檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平。7.將CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞與PI3K抑制劑處理過(guò)的CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞經(jīng)TNF-α(20ng/ml)與CHX(2μg/ml)誘導(dǎo)凋亡6h后,使用Hoechst染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,WB檢測(cè)GSK 3β蛋白的磷酸化水平,WB檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1.成功擴(kuò)增目的基因片段與重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a-ct036,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后His-瓊脂糖樹(shù)脂純化出高濃度的His-CT036重組蛋白。2.pET28a-ct036重組蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫4次后產(chǎn)生高效價(jià)抗體,經(jīng)ELISA與WB檢測(cè)多克隆抗體能識(shí)別His-CT036重組蛋白,且效價(jià)≥1:52000。3.IFA結(jié)果顯示假定功能蛋白CT036在感染細(xì)胞中的分布與已知的包涵體膜蛋白IncA的分布一致,表明CT036蛋白定位于衣原體感染細(xì)胞的包涵體膜。4.成功構(gòu)建了CT036慢病毒表達(dá)載體,慢病毒包裝完成后,測(cè)定慢病毒滴度較高,CT036慢病毒與Flag標(biāo)簽對(duì)照慢病毒感染HeLa細(xì)胞獲得了相應(yīng)的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系,倒置熒光顯微鏡觀察有明亮的綠色熒光,Western blot檢測(cè)有目的條帶。5.磷酸化iTRAQ相對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組與對(duì)照組的差異磷酸化蛋白,共鑒定到磷酸化蛋白質(zhì)3001個(gè)、磷酸化肽段7668個(gè)。按照表達(dá)倍數(shù)變化1.2倍以上且P value0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選得到388個(gè)差異表達(dá)磷酸化肽段,對(duì)應(yīng)301個(gè)蛋白。對(duì)這些蛋白進(jìn)行GO功能富集,可知CT036蛋白主要參與調(diào)控了細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、免疫進(jìn)程、囊泡運(yùn)輸?shù)榷喾N生物學(xué)過(guò)程。將篩選得到的53個(gè)參與調(diào)亡過(guò)程的蛋白和KEGG通路分析富集到的與凋亡相關(guān)的PI3K、mTOR、Chemokine等信號(hào)通路的蛋白取交集,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSK3β參與多條信號(hào)通路。WB檢測(cè)結(jié)果顯示CT036蛋白內(nèi)源性表達(dá)組與對(duì)照組相比GSK3β蛋白磷酸化水平明顯上升。6.Hoechst染色結(jié)果顯示:CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組凋亡率較陽(yáng)性對(duì)照組降低4.27%(P0.001);流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組凋亡率較陽(yáng)性對(duì)照組降低4.58%(P0.001)。WB檢測(cè)結(jié)果顯示CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組與對(duì)照組相比Bax表達(dá)明顯下調(diào),Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)。7.經(jīng)誘導(dǎo)凋亡處理后,Hoechst染色結(jié)果顯示:CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組凋亡率較陽(yáng)性對(duì)照組降低21.57%(P0.0001),較CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的PI3K抑制劑處理組降低23.47%(P0.0001);流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組凋亡率較陽(yáng)性對(duì)照組降低21.19%(P0.0001),較CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的PI3K抑制劑處理組降低21.84%(P0.0001);WB檢測(cè)結(jié)果顯示CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組與對(duì)照組相比GSK 3β發(fā)生明顯磷酸化,Bax表達(dá)明顯下調(diào),Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào),與CT036-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的PI3K抑制劑處理組相比GSK3β發(fā)生明顯磷酸化,Bax表達(dá)明顯下調(diào),Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)論1.沙眼衣原體假定功能蛋白CT036定位于衣原體感染細(xì)胞的包涵體膜。2.CT036的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)影響的差異磷酸化肽段所對(duì)應(yīng)的301個(gè)蛋白質(zhì)與衣原體感染相關(guān)的主要功能可能有調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、免疫進(jìn)程、囊泡運(yùn)輸及內(nèi)吞等。3.CT036可能通過(guò)促進(jìn)PI3K-Akt信號(hào)通路的GSK3β蛋白磷酸化而抑制細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R374
【圖文】：

圖 4.1 CT0366 基因的 PCR 電泳圖Fig. 4.1 PCR electropherogram of ct036 geneM：DNA Marke;1;: PCR amplification product of ct0.1.2 重組基因表達(dá)菌 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖 4.2 PCR 擴(kuò)增 CT036 轉(zhuǎn)化 E.coli BL2 菌的電泳結(jié)果Fig. 4.2 PCR electropherogram of CT036 transformed E.coli BL21 strainsM：DNA Marker；1-5：BL21 PCR amplification results

圖 4.4 CT036 重組蛋白的純化Fig. 4.4 Purification map of CT036 recombinant proteinM：Protein marker；FT：Flow through；1-3：Washes；4-6：Elutions 動(dòng)物免疫重組蛋白與重組蛋白的鑒定.1 重組蛋白免疫小鼠血清抗體效價(jià)分析以 450nm 相對(duì)吸光度值＞2.1 為陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)果表明重組蛋白能夠刺激小免疫反應(yīng)，第四次免疫后血清抗體滴度≥1：52000。.2.重組蛋白 Western Blot 鑒定

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本文編號(hào)：2774246