【摘要】：背景:隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,人工照明設(shè)備的使用范圍不斷擴(kuò)大,光污染也成為危害人類身體健康的危險(xiǎn)因素之一。環(huán)境中過量的光照射眼睛會(huì)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜發(fā)生損傷。且在一些常見的視網(wǎng)膜退行性眼科疾病中,如年齡相關(guān)的黃斑變性(Age related macular degeneration,AMD)以及視網(wǎng)膜色素變性(Retinitis pigmentosa,RP)等與視網(wǎng)膜光損傷的病理形態(tài)改變相似,因此,視網(wǎng)膜光損傷模型是研究許多眼科疾病的良好模型。既往對(duì)小鼠視網(wǎng)膜光損傷模型研究中證實(shí)fra-2發(fā)揮原癌基因作用,即上調(diào)Fra-2蛋白表達(dá)引起小鼠眼睛發(fā)育異常。分子量為46 kDa的Fra-2蛋白是轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(Activator protein 1,AP-1)蛋白家族的成員之一,有并由c-fos和c-jun兩個(gè)原癌蛋白基因組成。我們考慮在視網(wǎng)膜光損傷過程中Fra-2是否有參與及其作用機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)引起DNA的損傷,從而誘發(fā)各種胞內(nèi)反應(yīng),包括DNA修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯以及細(xì)胞凋亡等,嚴(yán)重的DNA損傷會(huì)導(dǎo)致DNA修復(fù)失敗,最終引起細(xì)胞凋亡。研究已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞核DNA的損傷可以迅速的激活多聚ADP核酶1(Poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP-1),并促進(jìn)ADP與PARP-1和其他核蛋白如組蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶的聚合。凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis inducing factor,AIF)作為線粒體氧化還原酶,具有催化細(xì)胞色素C和煙酰胺腺嘌呤而核苷酸(NAD)之間電子傳遞的作用,且PARP-1的過度激活會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞合成大量的PAR,從而促進(jìn)AIF從線粒體釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,從而激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。本研究通過建立小鼠光損傷模型以及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究Fra-2基因在視網(wǎng)膜光損傷中的可能作用機(jī)制。第一部分強(qiáng)光暴露對(duì)小鼠視網(wǎng)膜的損傷研究目的:通過建立小鼠視網(wǎng)膜光損傷模型,探究2600 Lux可見光暴露對(duì)小鼠視網(wǎng)膜的影響。方法:將小鼠放置在光照強(qiáng)度為2600 Lux的光照箱中飼養(yǎng)36 h建立小鼠視網(wǎng)膜光損傷模型。應(yīng)用HE染色觀察小鼠視網(wǎng)膜組織損傷情況,使用western blot檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜中PARP-1、Fra-2以及凋亡相關(guān)蛋白(Cyt-c、Bax、Blc-2、Bcl-xL)的表達(dá)水平。結(jié)果:本研究結(jié)果表明,2600 Lux可見光暴露12 h以后,小鼠視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)明顯損傷,具體表現(xiàn)為小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層和外核層明顯變薄,組織的裂解和細(xì)胞溶解,光感受器細(xì)胞外節(jié)段排列紊亂,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層出現(xiàn)凋亡;小鼠視網(wǎng)膜中兩種促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Cyt-c和Bax的表達(dá)從光暴露12 h開始均出現(xiàn)顯著性的上升,且兩種抑制凋亡的蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)從光暴露12 h開始均出現(xiàn)顯著性的下降;小鼠視網(wǎng)膜中PARP-1和Fra-2的蛋白水平在光暴露6h-36h以后逐漸顯著升高。結(jié)論:這些研究證實(shí)經(jīng)過2600 Lux強(qiáng)光暴露12 h以后,小鼠視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)明顯損傷;暴露36h后,小鼠視網(wǎng)膜受到強(qiáng)烈的損傷以及引起視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡,且Fra-2和PARP-1參與光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷中細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。第二部分過表達(dá)或者干擾表達(dá)Fra-2對(duì)RGC-5細(xì)胞的影響目的:探索過表達(dá)或干擾表達(dá)Fra-2基因?qū)GC-5細(xì)胞的影響方法:使用Far-2基因過表達(dá)或干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常RGC-5細(xì)胞,使用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況,western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá),MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:免疫熒光檢測(cè)以及western blot檢測(cè)證實(shí)Fra-2基因過表達(dá)/干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RGC-5細(xì)胞模型建立成功;過表達(dá)Fra-2基因顯著抑制RGC-5細(xì)胞的增殖活性以及誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞凋亡率的升高;過表達(dá)Fra-2基因顯著提高了 RGC-5細(xì)胞中PARP-1的蛋白表達(dá),以及促進(jìn)AIF從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移。結(jié)論:在正常RGC-5細(xì)胞中過表達(dá)Fra-2基因可以抑制細(xì)胞增殖活性以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且PARP-1/AIF信號(hào)途徑參與Fra-2過表達(dá)誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷。第三部分干擾Fra-2表達(dá)對(duì)光誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞損傷的影響目的:探究干擾Fra-2的表達(dá)對(duì)2600 Lux可見光暴露誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞損傷的影響方法:使用Fra-2干擾質(zhì)粒siFra-2轉(zhuǎn)染RGC-5細(xì)胞,并與2600Lux可見光暴露下培養(yǎng)72h(siFra-2+LE),以正常培養(yǎng)細(xì)胞作為正常對(duì)照組(Control group,CON)、不轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒但可見光暴露的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組(Light exposure group,LE)、采用PARP-1抑制劑NU1025處理可見光暴露的RGC-5細(xì)胞作為陽性對(duì)照(NU1025+LE),應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞增殖活性檢測(cè),western blot檢測(cè)PARP-1/AIF信號(hào)途徑蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:與正常對(duì)照組細(xì)胞相比,2600Lux可見光暴露后RGC-5細(xì)胞的凋亡率顯著上升且細(xì)胞增殖活性受到顯著的抑制;與光暴露組相比,轉(zhuǎn)染Fra-2干擾質(zhì)粒的RGC-5細(xì)胞經(jīng)過可見光暴露后,細(xì)胞凋亡率顯著下降且細(xì)胞的增殖活性顯著升高;與正常對(duì)照組相比,可見光暴露以后細(xì)胞中PARP-1的蛋白水平顯著升高,且AIF由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移;與可見光暴露組相比,轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的RGC-5細(xì)胞中PARP-1的蛋白水平顯著下降,且AIF由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移也顯著受到抑制。結(jié)論:干擾Fra-2的蛋白表達(dá)通過抑制RGC-5細(xì)胞內(nèi)PARP-1的合成釋放,以及降低RGC-5細(xì)胞質(zhì)中AIF向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移,減輕可見光暴露誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R774.1;R-332
【圖文】：

１．２結(jié)果逡逑１．２．１邋ＨＥ染色觀察光暴露對(duì)小鼠視網(wǎng)膜的損傷情況逡逑小鼠在２６００邋Ｌｕｘ光照強(qiáng)度暴露后，視網(wǎng)膜組織的ＨＥ染色結(jié)果如圖１－１所示。逡逑隨著光照暴露時(shí)間的延長，持續(xù)光照暴露１２邋ｈ以后小鼠的視網(wǎng)膜遭受嚴(yán)重破壞，逡逑主要損傷出現(xiàn)在內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，表現(xiàn)為組織的裂解和細(xì)胞溶解。光照暴逡逑露１２邋ｈ以后，小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層和外核層明顯變薄，出現(xiàn)組織溶解，光感受器逡逑細(xì)胞外節(jié)段排列紊亂，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層出現(xiàn)凋亡。對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常且單逡逑層排列緊密，各層次貼合良好，組織無明顯溶解和脫落。光暴露６邋ｈ組小鼠視網(wǎng)逡逑膜結(jié)構(gòu)正常，與對(duì)照相比無明顯變化。逡逑對(duì)照組邐光照６邋ｈ逡逑＿＿逡逑光照１２邋ｈ邐光照２４邋ｈ邐光照３６邋ｈ逡逑圖１．１邋ＨＥ染色觀察持續(xù)光照對(duì)小鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的損傷（４００Ｘ）逡逑１８逡逑

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本文編號(hào)：2727018