【摘要】：目的:骨缺損、骨不連是臨床常見的骨科疾病,組織工程骨是治療上述疾病的有效手段。間充質(zhì)干細胞(MSCs)是組織骨工程理想的種子細胞,在適當骨向分化誘導因子作用下可定向骨分化。BMP9是最強的成骨分化誘導因子之一,但其誘導MSCs骨向分化仍需其他因子參與調(diào)節(jié)。Wnt10b能促進MSCs骨向分化并抑制脂肪分化,可能是增強BMP9作用的重要分子。本研究主要探索Wnt10b對BMP9誘導MSCs骨向分化的作用及其相關(guān)機制。方法:利用重組腺病毒介導相應因子過表達/沉默;采用PCR、Western Blot檢測成骨及成脂分化指標;茜素紅染色實驗檢測細胞礦化;Micro-CT、組織化學染色檢測異位骨形成情況;油紅O染色實驗檢測間充質(zhì)干細胞脂分化結(jié)果;PCR、Western Blot、ChIP和IP等實驗分析相關(guān)分子機制。結(jié)果:BMP9能上調(diào)各種干細胞中Wnt10b的表達水平。在C3H10T1/2細胞中,過表達Wnt10b明顯增強BMP9相關(guān)成骨指標物的作用,如Runx2、Dlx-5、OPN、OCN等,而沉默Wnt10則減弱BMP9對相應成骨分化標志物的影響;過表達Wnt10b增強BMP9促進間充質(zhì)干細胞礦化的作用,并明顯促進BMP9誘導異位成骨的能力,而沉默Wnt10b則導致BMP9誘導骨形成的能力明顯減弱。Wnt10b可促進BMP9上調(diào)Smad1/5/8的磷酸化水平,同時下調(diào)BMP9對成脂關(guān)鍵因子PPARγ及C/EBPα蛋白及mRNA表達水平的促進作用。BMP9上調(diào)CREB的磷酸化水平,COX-2能促進這一作用。p-CREB及p-Smad1/5/8相互作用并參與調(diào)節(jié)Wnt10b表達。結(jié)論:Wnt10b能促進BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化,機制可能與Wnt10b通過促進BMP/Smad信號并抑制脂分化有關(guān);BMP9可能通過COX-2促進CREB磷酸化水平,后者與p-Smad1/5/8相互作用共同參與調(diào)節(jié)Wnt10b表達。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2;R68
【圖文】：

圖1.1Wnt10b mRNA在不同干細胞中的表達（n=3）Fig 1.1 The relative mRNAlevel of Wnt10b in different stem cells（n=3）圖1.2 BMP9對C3H10T1/2細胞中Wnt10b mRNA表達的影響（n=3）

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文21圖1.7 BMP9對C3H10T1/2細胞中Wnt10b表達的影響（n=3）Fig 1.7 Effects of BMP9 on expression of Wnt10b in C3H10T1/2 cells（n=3）2.2 Wnt10b 對 BMP9 誘導 C3H10T1/2 細胞骨向分化的影響PCR 結(jié)果顯示，外源性過表達 Wnt10b 能明顯促進 BMP9 上調(diào) C3H10T1/2中早期成骨指標 Dlx-5 以及 Runx2 的 mRNA 水平的作用（圖 1.8、圖 1.9），同樣的結(jié)果在 Western Blot 分析中得到證實（圖 1.10）。PCR 與 Western Blot 結(jié)果同樣顯示，Wnt10b 可以促進 BMP9 上調(diào) C3H10T1/2 細胞中 OPN 與 OCN 的蛋白水平（圖 1.11）。茜素紅染色結(jié)果證實 Wnt10b 促進 BMP9 誘導 C3H10T1/2 細胞礦化的作用（圖 1.12）。沉默 Wnt10b 后，BMP9 的上述作用都不同程度受到抑制(圖 1.13-圖 1.16）。以上結(jié)果顯示，Wnt10b 可促進 BMP9 誘導 C3H10T1/2細胞的骨向分化。

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