【摘要】：2005年,研究者從急性呼吸道感染的幼兒患者鼻黏提取物中分離并鑒定出一種新的病毒,命名為人博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)。人博卡病毒是繼B19后第二種與人類疾病相關的細小病毒,同時也是細小病毒科博卡病毒屬中牛細小病毒(BPV)和犬細小病毒(MVC)之外第三個成員(1,2)。人博卡病毒共有四個亞型,本研究中所研究的是I型,即HBoV1。HBov1感染引發(fā)呼吸道相關疾病,但是其致病機理至今仍未闡明。HBoV1是單鏈DNA病毒,基因組大小約為5.5kb,末端重復序列形成發(fā)卡結構。病毒的mRNA均由P5起東西進行轉錄,經RNA可變剪接與加工,形成成熟的mRNA,主要編碼非結構蛋白NS1-4及NS1-70,博卡病毒屬特有蛋白NP1,以及結構蛋白VP1、VP2和VP3。VP1作為質量最大的結構蛋白,其N端的129個氨基酸殘基被稱為VP1特有序列(VP1 unique sequence,VP1u),具有A2磷酸酶活性,對病毒入侵細胞起到重要作用。VP3作為最小的結構蛋白,是衣殼的主要組成部分。病毒粒子中VP1/2/3的含量比例約為1:1:10,主要由轉錄子R6,R7,R8編碼。由于VP1/2/3共享C端氨基酸序列,其編碼序列部分重疊,HBoV1如何調控翻譯過程,使得編碼框位于下游的VP3蛋白表達水平顯著高于VP1蛋白?這種調控過程對于HBoV1的病毒生命周期又產生怎樣的影響?HBoV1結構蛋白的可變翻譯對于病毒的整個生命周期的影響及其分子機制,是本研究需要解決的核心科學問題。本研究通過同位素標記的體外共轉錄與翻譯實驗證明了HBoV1結構蛋白存在可變翻譯現(xiàn)象。含有vp1基因的轉錄結構是多順反子,能夠同時翻譯出VP1/2/3三個結構蛋白,且5’UTR序列對于蛋白的翻譯具有調控作用。并且通過實驗證明,5’UTR是HBoV1結構蛋白VP1/2/3在真核細胞HEK293T內表達所必需的序列,不僅影響著結構蛋白的翻譯效率,同時也對結構蛋白RNA的轉錄起到促進作用。由于真核細胞的5’UTR中存在多樣化的調控元件,影響著下游基因的翻譯水平。本研究構建了雙熒光報告載體用以驗證5’UTR及VP1u中是否含有能夠介導VP3表翻譯的中間核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES),排除了IRES參與VP1/2/3可變翻譯的可能。同時,我們證明VP1/2/3的可變翻譯是一個由上游開放閱讀框(upstream open reading frame,uORF)介導的核糖體掃描滲透過程。uORF不僅在翻譯層面上調控VP1/2/3的可變翻譯,同時也在轉錄水平上影響HBoV1的RNA剪接與加工過程。本研究在HBoV1感染性克隆上針對性的突變uORF的起始密碼子序列,發(fā)現(xiàn)uATG的突變并不影響HBoV1感染性克隆轉染后病毒基因組復制水平,但是uATG23的突變顯著改變VP1/2/3的翻譯比例,增加了VP1的翻譯效率,同時也影響子代病毒的生成,對HBoV1的生命周期起到至關重要的影響作用。此外,通過逐步截短5’UTR序列,本研究鑒定出HBoV1的R6轉錄子5’UTR中存在決定結構蛋白RNA豐度的順式作用元件,是5’UTR中除開uORF之外的一個影響病毒RNA轉錄水平的調控元件。本研推進了目前對于人博卡病毒結構蛋白的研究進展,為人博卡病毒的防治提供了新的理論支撐。
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院武漢病毒研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R373
【圖文】：

圖 1.1 HBoV1 基因組結構示意圖及轉錄圖譜。基因組末端具有回文序列，形成發(fā)卡結構。左末端的回文序列部分對稱，形成兔耳朵形態(tài)的二級結構。右末端的回文結構完全對稱，形成標準的發(fā)卡結構。病毒基因組含有 3 個(pA)p 位點以及 2個(pA)d 位點，4 個可變剪接供體位點（D1，D1’，D2 和 D3），4 個可變剪接受體位點（A1，A1’，A2，A3）。HBoV1 通過 P5 啟動子轉錄，轉錄出的 pre-mRNA在這些位點選擇性的進行 RNA 剪接以及添加 poly(A)尾巴，形成成熟的 mRNA，4

圖 1.2 真核生物經典帽子依賴的核糖體掃描翻譯起始模型(46-50)。核糖體 40S 亞基、甲硫氨酰 tRNA、GTP 以及真核翻譯起始因子 2 形成的四聚體通過真核翻譯起始因子招募到 mRNA 的 m7G 帽子結構上，形成 43S 的翻譯起始復合體前體，并在 mRNA 的 5’UTR 上進行掃描，直至遇到合適的翻譯起始位點。核糖體 60S亞基在eIF5B水解GTP的幫助下，加入PIC復合體，隨后真核翻譯起始因子釋放，形成翻譯起始復合體并往下游延伸，進行蛋白的翻譯。Figure 1.2 Canonical eukaryotic cap-dependet translation initation (46-50). eIFs,eukaryotic initiation factors. 40S, 40S ribosome subunit. 60S, 60S ribosome subunit.PABP, poly(A) binding protein. 5’UTR, 5’ untranslated region. 3’UTR, 3’untranslated region.絕大多數(shù)的真核細胞 mRNA 屬于單順反子轉錄子，在其翻譯起始位點之前沒有額外的 AUG 起始密碼子。在 Kozak 構建的翻譯起始核糖體掃描模型中，核

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本文編號：2724960