【摘要】：2005年,研究者從急性呼吸道感染的幼兒患者鼻黏提取物中分離并鑒定出一種新的病毒,命名為人博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)。人博卡病毒是繼B19后第二種與人類(lèi)疾病相關(guān)的細(xì)小病毒,同時(shí)也是細(xì)小病毒科博卡病毒屬中牛細(xì)小病毒(BPV)和犬細(xì)小病毒(MVC)之外第三個(gè)成員(1,2)。人博卡病毒共有四個(gè)亞型,本研究中所研究的是I型,即HBoV1。HBov1感染引發(fā)呼吸道相關(guān)疾病,但是其致病機(jī)理至今仍未闡明。HBoV1是單鏈DNA病毒,基因組大小約為5.5kb,末端重復(fù)序列形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。病毒的mRNA均由P5起東西進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,經(jīng)RNA可變剪接與加工,形成成熟的mRNA,主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1-4及NS1-70,博卡病毒屬特有蛋白NP1,以及結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3。VP1作為質(zhì)量最大的結(jié)構(gòu)蛋白,其N(xiāo)端的129個(gè)氨基酸殘基被稱為VP1特有序列(VP1 unique sequence,VP1u),具有A2磷酸酶活性,對(duì)病毒入侵細(xì)胞起到重要作用。VP3作為最小的結(jié)構(gòu)蛋白,是衣殼的主要組成部分。病毒粒子中VP1/2/3的含量比例約為1:1:10,主要由轉(zhuǎn)錄子R6,R7,R8編碼。由于VP1/2/3共享C端氨基酸序列,其編碼序列部分重疊,HBoV1如何調(diào)控翻譯過(guò)程,使得編碼框位于下游的VP3蛋白表達(dá)水平顯著高于VP1蛋白?這種調(diào)控過(guò)程對(duì)于HBoV1的病毒生命周期又產(chǎn)生怎樣的影響?HBoV1結(jié)構(gòu)蛋白的可變翻譯對(duì)于病毒的整個(gè)生命周期的影響及其分子機(jī)制,是本研究需要解決的核心科學(xué)問(wèn)題。本研究通過(guò)同位素標(biāo)記的體外共轉(zhuǎn)錄與翻譯實(shí)驗(yàn)證明了HBoV1結(jié)構(gòu)蛋白存在可變翻譯現(xiàn)象。含有vp1基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)是多順?lè)醋?能夠同時(shí)翻譯出VP1/2/3三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,且5’UTR序列對(duì)于蛋白的翻譯具有調(diào)控作用。并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明,5’UTR是HBoV1結(jié)構(gòu)蛋白VP1/2/3在真核細(xì)胞HEK293T內(nèi)表達(dá)所必需的序列,不僅影響著結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯效率,同時(shí)也對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白R(shí)NA的轉(zhuǎn)錄起到促進(jìn)作用。由于真核細(xì)胞的5’UTR中存在多樣化的調(diào)控元件,影響著下游基因的翻譯水平。本研究構(gòu)建了雙熒光報(bào)告載體用以驗(yàn)證5’UTR及VP1u中是否含有能夠介導(dǎo)VP3表翻譯的中間核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES),排除了IRES參與VP1/2/3可變翻譯的可能。同時(shí),我們證明VP1/2/3的可變翻譯是一個(gè)由上游開(kāi)放閱讀框(upstream open reading frame,uORF)介導(dǎo)的核糖體掃描滲透過(guò)程。uORF不僅在翻譯層面上調(diào)控VP1/2/3的可變翻譯,同時(shí)也在轉(zhuǎn)錄水平上影響HBoV1的RNA剪接與加工過(guò)程。本研究在HBoV1感染性克隆上針對(duì)性的突變uORF的起始密碼子序列,發(fā)現(xiàn)uATG的突變并不影響HBoV1感染性克隆轉(zhuǎn)染后病毒基因組復(fù)制水平,但是uATG23的突變顯著改變VP1/2/3的翻譯比例,增加了VP1的翻譯效率,同時(shí)也影響子代病毒的生成,對(duì)HBoV1的生命周期起到至關(guān)重要的影響作用。此外,通過(guò)逐步截短5’UTR序列,本研究鑒定出HBoV1的R6轉(zhuǎn)錄子5’UTR中存在決定結(jié)構(gòu)蛋白R(shí)NA豐度的順式作用元件,是5’UTR中除開(kāi)uORF之外的一個(gè)影響病毒RNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控元件。本研推進(jìn)了目前對(duì)于人博卡病毒結(jié)構(gòu)蛋白的研究進(jìn)展,為人博卡病毒的防治提供了新的理論支撐。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R373
【圖文】：

圖 1.1 HBoV1 基因組結(jié)構(gòu)示意圖及轉(zhuǎn)錄圖譜。基因組末端具有回文序列，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。左末端的回文序列部分對(duì)稱，形成兔耳朵形態(tài)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。右末端的回文結(jié)構(gòu)完全對(duì)稱，形成標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。病毒基因組含有 3 個(gè)(pA)p 位點(diǎn)以及 2個(gè)(pA)d 位點(diǎn)，4 個(gè)可變剪接供體位點(diǎn)（D1，D1’，D2 和 D3），4 個(gè)可變剪接受體位點(diǎn)（A1，A1’，A2，A3）。HBoV1 通過(guò) P5 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄出的 pre-mRNA在這些位點(diǎn)選擇性的進(jìn)行 RNA 剪接以及添加 poly(A)尾巴，形成成熟的 mRNA，4

圖 1.2 真核生物經(jīng)典帽子依賴的核糖體掃描翻譯起始模型(46-50)。核糖體 40S 亞基、甲硫氨酰 tRNA、GTP 以及真核翻譯起始因子 2 形成的四聚體通過(guò)真核翻譯起始因子招募到 mRNA 的 m7G 帽子結(jié)構(gòu)上，形成 43S 的翻譯起始復(fù)合體前體，并在 mRNA 的 5’UTR 上進(jìn)行掃描，直至遇到合適的翻譯起始位點(diǎn)。核糖體 60S亞基在eIF5B水解GTP的幫助下，加入PIC復(fù)合體，隨后真核翻譯起始因子釋放，形成翻譯起始復(fù)合體并往下游延伸，進(jìn)行蛋白的翻譯。Figure 1.2 Canonical eukaryotic cap-dependet translation initation (46-50). eIFs,eukaryotic initiation factors. 40S, 40S ribosome subunit. 60S, 60S ribosome subunit.PABP, poly(A) binding protein. 5’UTR, 5’ untranslated region. 3’UTR, 3’untranslated region.絕大多數(shù)的真核細(xì)胞 mRNA 屬于單順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄子，在其翻譯起始位點(diǎn)之前沒(méi)有額外的 AUG 起始密碼子。在 Kozak 構(gòu)建的翻譯起始核糖體掃描模型中，核

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