【摘要】：細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在維持正常發(fā)育和組織功能方面發(fā)揮著重要作用。膠原XV(ColXV)位于基底膜最外層,屬于MULTIPLEXINs膠原蛋白亞類的一員。ColXV在小鼠模型中被發(fā)現(xiàn)可抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成,并抑制腫瘤生長(zhǎng)。小鼠皮下脂肪組織中檢測(cè)到ColXV有較高的表達(dá)水平,此外分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞中ColXV的表達(dá)量顯著增加。ColXV以及基底膜型分子的表達(dá)與脂肪組織發(fā)育相關(guān),并在沉脂分化過程中上調(diào)。然而,脂肪組織基底膜區(qū)的ColXV的存在和功能尚未得到充分認(rèn)識(shí)。這種特殊的ECM分子為脂肪組織提供了一個(gè)關(guān)鍵的微環(huán)境,可能影響脂肪細(xì)胞本身的生物活性,并與其他組織相互作用。ColXV作為連接脂肪細(xì)胞基底膜和基底膜外細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和脂肪組織細(xì)胞外基質(zhì)積累引起相關(guān)炎癥發(fā)生的作用機(jī)制尚不清楚。本研究在脂肪細(xì)胞上超表達(dá)和干擾ColXV基因,通過RT-PCR,WB等分子學(xué)方法和形態(tài)學(xué)觀察檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥相關(guān)因子變化,探究了ColXV通過促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控脂肪組織炎癥的相關(guān)分子機(jī)制。本研究為解決細(xì)胞外基質(zhì)異常積累引起的脂肪組織代謝紊亂和治療肥胖相關(guān)代謝疾病提供理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)得到以下結(jié)果:1.ColXV通過激活I(lǐng)ntegrinβ1/FAK信號(hào)促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在正常水平以及FAK抑制劑PF-573228處理下分別驗(yàn)證ColXV對(duì)脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。超表達(dá)ColXV后,脂肪細(xì)胞中IRE1α、CHOP、GRP78的mRNA和蛋白水平顯著增加(P0.05),干擾ColXV后作用相反。此外,超表達(dá)ColXV促進(jìn)了ColXV與其膜受體Integrinβ1的結(jié)合,顯著促進(jìn)了FAK~((Y397))的磷酸化水平(P0.05),FAK抑制劑PF-573228抑制了FAK的磷酸化,逆轉(zhuǎn)了ColXV誘導(dǎo)的IRE1α、CHOP、GRP78的蛋白表達(dá)水平的上升趨勢(shì)。表明ColXV通過促進(jìn)Integrinβ1/FAK信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。2.ColXV通過IP3R1鈣通道破壞鈣離子平衡促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在3T3-L1細(xì)胞中超表達(dá)ColXV顯著促進(jìn)IP3R1表達(dá)水平的上調(diào)。此外通過鈣離子熒光探針染色顯示超表達(dá)ColXV顯著上調(diào)了細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。在正常水平以及IP3R通道抑制劑2-APB處理下分別驗(yàn)證ColXV對(duì)脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。2-APB的處理顯著抑制了ColXV誘導(dǎo)的IRE1α、CHOP、GRP78的蛋白表達(dá)水平的上升(P0.05)。表明ColXV通過影響脂肪細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。3.ColXV通過IRE1α/XBP1通路促進(jìn)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥。在3T3-L1細(xì)胞中超表達(dá)ColXV顯著促進(jìn)IRE1α、CHOP、GRP78的表達(dá)(P0.05),干擾ColXV后作用相反。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針染色顯示,ColXV處理使脂肪細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔有增大的跡象(P0.05)。在衣霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型下,顯著上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因IRE1α、CHOP、GRP78的mRNA及蛋白的表達(dá)量(P0.05)。同時(shí),超表達(dá)ColXV促進(jìn)顯著促進(jìn)uXBP1剪切為sXBP1(P0.05),干擾ColXV后作用相反。同時(shí),加入IRE1抑制劑STF083010和4μ8C后,脂肪細(xì)胞炎癥相關(guān)基因IL6,TNFα的表達(dá)含量顯著下降(P0.05)。表明ColXV通過促進(jìn)IRE1α/XBP1通路上調(diào)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥。綜上所述,本研究證明了ColXV通過激活I(lǐng)ntegrinβ1/FAK信號(hào)通路以及破壞細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡來誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。ColXV通過促進(jìn)IRE1α/XBP1信號(hào)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥。本研究為解決細(xì)胞外基質(zhì)異常積累導(dǎo)致脂肪組織代謝紊亂問題提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R364.5
【圖文】：

ColXV 由 1388 個(gè)氨基酸殘基組成，ColXV 和 ColXVIII 分子 C 端具有較強(qiáng)序列和構(gòu)同源性的均三聚體。三聚體是由相同的多肽組成的，沒有已知的剪接變體。530 個(gè)基的 N 端域以及 215 殘基 TSPN-1 (N 端血小板反應(yīng)蛋白-1)，它存在于許多纖維膠原非纖維膠原中，其次是含有許多膠原十五特有片段，附加的一段 577 殘基內(nèi)膠原不連中斷序列位于二尖瓣末端區(qū)域。其中包含多個(gè)三螺旋結(jié)構(gòu)域(ColXV 有 9 個(gè)，ColXV有 10 個(gè))和一個(gè) N 端血小板反應(yīng)蛋白-1 結(jié)構(gòu)域，N 端為信號(hào)肽序列(Kivirikko et al., 199Myers et al., 2007)。中央間斷的膠原域包含 9 個(gè)膠原子域分由 N-端到 C-端依次包含 11435、45、71、30、18、55、15 個(gè)氨基酸殘基，八個(gè)主要的中斷分別包含 45、31、2411、34、14、7、10 個(gè)氨基酸殘基。膠原結(jié)構(gòu)域占總長(zhǎng)度的三分之二。每個(gè)膠原子域含一個(gè)或多個(gè) Gly-X-Y 三聯(lián)體重復(fù)序列（其中“X”和“Y”可以是任何氨基酸，通常為氨酸和羥脯氨酸）(Hagg et al., 1997)。Col XV 和 Col XVIII 在結(jié)構(gòu)上具有高度同源性前三分之一的非膠原序列是 XV 型特異性的，而后三分之二的序列與 XVIII 型膠原的皮抑素肽 60%相同，并且兩者都由連接區(qū)、鉸鏈區(qū)和內(nèi)皮抑素結(jié)構(gòu)域組成(Sasaki et a2000)。

3-1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白動(dòng)態(tài)合成途徑(Wan and Jiang., 201ure 3-1Dynamic synthesis of endoplasmic reticulum pr存、修飾和運(yùn)輸新合成的蛋白質(zhì)方面發(fā)揮作，其腔內(nèi)濃度范圍從高微摩爾到低毫摩爾不等胞質(zhì)高 4 到 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。這種陡峭的濃度梯體、ryanodine 受體(RyR)和泄漏通道)離開 E+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的接收器，也可作為細(xì)胞內(nèi) Ca2+信P 酶(SERCA)泵將胞質(zhì) Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)到腔內(nèi)。Ca2+處于空閑、非緩沖狀態(tài)；雖然在某些細(xì)胞[Ca2+]的范圍從 100 到 800μM 不等(Bygrave快速擴(kuò)散(比通過胞質(zhì)更快)，然而，大容量的用。鈣網(wǎng)蛋白是最豐富的緩沖蛋白，含有 20的緩沖區(qū)是獨(dú)特的，因?yàn)樗�作為伴侶蛋白

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