【摘要】：研究背景:成體神經干細胞(Neural stem cells,NSCs)是一類局限在成年神經系統(tǒng)特定部位的、可以發(fā)揮持續(xù)增殖以及多潛能分化功能的細胞。它們對于腦組織完整細胞結構的維持和正常功能的發(fā)揮具有重要作用。在成年小鼠大腦中,腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ)是NSCs及其子代細胞聚集的主要部位,這些增殖旺盛的細胞在小鼠整個生命過程中保持自我更新的能力,其中一部分經過遷移到達嗅球,分化為嗅球中間神經元。成體神經干細胞的這一生理過程受到多種因子的調控,比如細胞外信號BMP和Notch參與維持NSCs的靜息狀態(tài),Wnt信號能促進NSCs及其子代細胞增殖并激活神經發(fā)生過程。然而,有關細胞內在因素對NSCs的調控作用,目前尚不清楚。拓撲異構酶Ⅱa(TopoisomeraseⅡa,Top2a)是哺乳動物細胞核內廣泛存在的一類酶,它可以催化DNA雙鏈的斷裂與重連,從而改變DNA鏈的拓撲學結構,對于細胞復制、RNA轉錄以及DNA損傷修復等過程起到重要作用。Top2a對于細胞分裂增殖過程極其重要,在胚胎發(fā)育中敲除Top2a會導致胚胎發(fā)育停滯在4細胞或8細胞狀態(tài)。然而,在神經發(fā)育過程中,尤其是在成體神經發(fā)生中,Top2a的作用還未見報道。實驗方法:我們利用生物信息學的方法篩選出多個可能對成體神經發(fā)生起作用的候選基因,并通過RT-PCR、Western Blotting等方法對這些候選基因在NSCs中的表達進行了驗證,并從中選定Top2a作為研究的目標分子。通過免疫熒光染色方法,我們對Top2a在成年小鼠中樞神經系統(tǒng)中的表達模式進行了分析。然后,利用Top2a的特異的抑制劑、RNA干擾質粒以及條件性誘導的敲除小鼠對其在成體NSCs中的作用進行了探究。最后,利用CHIP-seq和RNA-seq技術對Top2a的作用機制和下游靶點進行了探索。主要結果:通過分析已有的芯片和測序數據,我們篩選出了多個NSCs的潛在特征性基因,包括Aurka、Aurkb、Birc5、Bub1b、Ccna2、Cdc20、Cdc25c、Cdc45、Cdc6、Cdk1、Cdt1、Cenpa、Cenpf、Dbf4、Dlgap5、Kif23、Kif2c、Mcm3、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Plk1、Top2a和Ube2c等。經蛋白水平上驗證,這些基因當中Kif2c和Top2a特異地表達在NSCs上。因此,我們選取Top2a作為目標分子,研究其在成體神經發(fā)生中的作用。通過分析Top2a在中樞神經系統(tǒng)內的表達模式,我們發(fā)現該分子特異地表達在成年小鼠的SVZ和RMS中,其它腦區(qū)幾乎不表達;并且這種表達的空間特異性在發(fā)育早期就已經決定。另外,通過分析SVZ處Top2a的細胞定位,我們發(fā)現它主要表達在NPCs以及活化的NSCs中。通過體外培養(yǎng)SVZ來源的成體神經干細胞,我們發(fā)現Top2a被抑制后,干細胞的生長狀態(tài)明顯下降,且其增殖能力顯著降低。同時,我們還構建了條件性誘導的基因敲除小鼠,發(fā)現體內敲除Top2a可以明顯抑制成體SVZ處神經發(fā)生過程,并使該處增殖細胞的數目明顯減少,從而導致嗅球內新生神經元的數量顯著降低。通過CHIP-seq和RNA-seq檢測分析,我們進一步揭示了Top2a對NSCs轉錄組的影響,發(fā)現了310個可能的Top2a直接作用的下游靶基因,為揭示成體神經發(fā)生中Top2a發(fā)揮功能的分子機制奠定了基礎。結論:根據目前的研究結果,我們可以得到如下結論:1、Top2a是神經干細胞表達的一個特征性分子。2、與Top2b(Top2a的同源異構體)比較,Top2a主要表達在成體SVZ和RMS部位,具有獨有的時間-空間表達模式。3、體外干擾或者抑制Top2a后,神經干細胞球的正常生長受到抑制,說明Top2a是維持體外NSCs正常增殖和生長的關鍵分子。4、在小鼠體內條件性敲除Top2a后,SVZ處的神經發(fā)生受到抑制,并且影響了嗅球內新生中間神經元的產生。5、由Top2a在全基因組上的結合位點以及敲除Top2a后各個基因的差異表達,我們推測核孔蛋白Nu153和轉錄因子Sox2可能是介導Top2a功能的下游靶基因。
【圖文】：

導其到下一個 DNA 切斷位點yb Top2a 啟動子 反式激活 Top2a [61]BP90 Top2a 啟動子的 ICB2 元件 使內源 Top2a 表達上調 [62]1 結合于 Top2a 啟動子的近端和遠端 GC 元件對 Top2a 起轉錄激活作用 [63]3 結合于 Top2a 啟動子的遠端 GC 元件對 Top2a 起轉錄抑制作用 [63]-M Top2a 啟動子 最強的 Top2a 反式激活因子，受內源性調控程度低[64]s1p 不詳 為 Top2 發(fā)揮分離染色體功能所必需，維持正常的細胞生長狀態(tài)[65]M 不詳 Sgs1p 同源類似物，，人體缺乏可導致 Bloom 綜合征[66]atenin 結合于Top2a 的 951 1301氨基酸加快 Top2a 的作用循環(huán) [67]1 作用于 Top2a 的 Ser1337和Ser1524使Top2a作用部位的絲氨酸磷酸化，調控細胞周期進程[68]
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R338

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 盧圣鋒;尹海燕;喬秀蘭;余曙光;唐勇;;神經細胞黏附分子、多聚唾液酸及其復合體與成年神經發(fā)生[J];國際神經病學神經外科學雜志;2009年02期

2 鐘靜;唐民科;徐秋萍;馮衛(wèi)紅;張均田;;神經發(fā)生與腦缺血疾病治療[J];醫(yī)學研究雜志;2006年08期

3 黃河清;司良毅;;腦缺血后內源性神經發(fā)生影響因素的研究進展[J];中華老年心腦血管病雜志;2009年04期

4 孫開宏;王坤;;運動對應激的保護效應與成年神經發(fā)生的關系[J];中國康復醫(yī)學雜志;2018年11期

5 方鑫;王芙蓉;姜亞平;;內源性神經發(fā)生治療Alzheimer病[J];卒中與神經疾病;2008年05期

6 盧圣鋒;尹海燕;于美玲;余曙光;唐勇;;海馬神經發(fā)生與腦老化及針灸促神經發(fā)生效應[J];中國老年學雜志;2012年24期

7 肖娟娟;;應激對成年海馬神經發(fā)生的影響[J];咸寧學院學報(醫(yī)學版);2008年04期

8 許志強;周華東;;成年哺乳動物海馬齒狀回神經發(fā)生的研究進展[J];中華老年心腦血管病雜志;2009年02期

9 黃濤;徐波;趙永才;夏志;;運動對海馬齒狀回顆粒細胞下層神經發(fā)生的促進作用及其與學習記憶能力關系研究進展[J];中國運動醫(yī)學雜志;2011年06期

10 包春瑩;;研究神經發(fā)生的方法[J];生物學通報;2006年05期

相關會議論文 前10條

1 張義偉;劉娟;鄭艷宇;馬江波;;癲癇發(fā)作對海馬神經發(fā)生的影響[A];中國解剖學會2012年年會論文文摘匯編[C];2012年

2 孫曉羽;趙傳勝;;氟西汀對缺血后大鼠神經發(fā)生及運動功能的影響[A];中華醫(yī)學峰會暨中華醫(yī)學會神經病學分會第八屆全國中青年神經病學學術會議論文匯編[C];2015年

3 盛寶英;黃作義;張曉梅;魏春杰;鄒春穎;;bFGF和BDNF對MCAO大鼠海馬區(qū)神經發(fā)生的研究[A];第十一屆全國神經病學學術會議論文匯編[C];2008年

4 辛佳蔚;章軍建;楊英;;當歸對血管性認知損害的保護作用及其與成體神經發(fā)生的關系[A];中華醫(yī)學會第十七次全國神經病學學術會議論文匯編（上）[C];2014年

5 王冰;Xie Zhen;Zhang Xiao;Zhao Haibo;Wang Li;Du Fang;Han Junliang;Zhang Yunxia;Chen Jing;Hu Gengyao;Xiao Bing;Liu Yang;Shi Ming;Zhao Gang;;人參皂苷Rd保護癡呆模型大鼠神經發(fā)生的機制研究[A];中華醫(yī)學會第十七次全國神經病學學術會議論文匯編（上）[C];2014年

6 李凱凱;王久濤;成欣然;聶于菲;韓旭;孫宇姝;趙善廷;;小鼠產前鉛中毒對子代神經發(fā)生的影響研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物解剖及組織胚胎學分會第十九次學術研討會論文集[C];2016年

7 李達兵;徐海偉;;海馬成年神經發(fā)生與AD病理生理發(fā)展的關系研究[A];中國生理學會張錫鈞基金會第十屆全國青年優(yōu)秀生理學學術論文綜合摘要[C];2009年

8 杜蕊;張學乾;楊慈清;陳樹林;趙慧英;趙善廷;;豬與小鼠海馬成體神經發(fā)生以及海馬結構特征的對比分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物解剖學及組織胚胎學分會第十七次學術研討會論文集（下）[C];2012年

9 高長越;張莉莉;谷鵬鵬;李敬誠;;P75NTR-ECD對AD小鼠海馬神經發(fā)生的影響[A];中華醫(yī)學峰會暨中華醫(yī)學會神經病學分會第八屆全國中青年神經病學學術會議論文匯編[C];2015年

10 鐘春玖;趙娜;汪洋;趙艷玲;周國民;洪震;;病理損害前期硫胺素缺乏下調成體海馬神經發(fā)生及其與學習功能相關性的實驗研究[A];第九次全國神經病學學術大會論文匯編[C];2006年

相關博士學位論文 前10條

1 秦尚堯;拓撲異構酶Ⅱa在小鼠SVZ成體神經發(fā)生過程中的作用和機制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學;2019年

2 馮展鵬;垂體柄損傷后下丘腦神經發(fā)生規(guī)律、作用及機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

3 楊鐘熙;年齡相關的BubR1水平下降對成體海馬神經發(fā)生受損的研究[D];吉林大學;2017年

4 周永紅;復健片促進缺血性卒中神經發(fā)生作用研究[D];山東中醫(yī)藥大學;2005年

5 王紀文;反復新生期大鼠癇性發(fā)作對神經發(fā)生的影響及其遠期后果[D];山東大學;2005年

6 張文平;乙酰膽堿對大鼠成年神經發(fā)生和學習與記憶的作用及其機制研究[D];山西醫(yī)科大學;2007年

7 金曉晴;丁苯酞對神經發(fā)生中BDNF通路的激活和神經元細胞增殖的促進作用[D];武漢大學;2016年

8 孫佳琦;sFRP3和乙酰膽堿對成體海馬神經發(fā)生的活動依賴性調控[D];清華大學;2014年

9 江文;實驗性癲癇發(fā)作誘導海馬齒狀回神經發(fā)生的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2002年

10 杜來玲;TRPC1對豐富環(huán)境誘導的成年海馬神經發(fā)生及認知功能增強的影響及其機制研究[D];華中科技大學;2014年

相關碩士學位論文 前10條

1 楊雪梅;Wnt/β-catenin信號通路在姜黃素促腦缺血后海馬神經發(fā)生中的作用研究[D];重慶醫(yī)科大學;2018年

2 劉蒙蒙;圍產期暴露苦馬豆素對小鼠海馬和嗅球神經發(fā)生的影響[D];西北農林科技大學;2019年

3 李凱凱;百草枯對小鼠海馬和皮層神經發(fā)生的毒性研究[D];西北農林科技大學;2018年

4 李孟宇;六味地黃湯及其活性部位對阿爾茨海默病模型小鼠神經發(fā)生的作用研究[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

5 曾慶樺;丙戊酸鈉對APP/PS1/Nestin-GFP三轉基因癡呆小鼠海馬神經發(fā)生作用的初步研究[D];重慶醫(yī)科大學;2016年

6 陸樂;自主運動對小鼠學習記憶及海馬神經發(fā)生的影響[D];華東師范大學;2013年

7 張學乾;豬與小鼠海馬成體神經發(fā)生以及海馬結構特征的對比分析[D];西北農林科技大學;2012年

8 朱紅梅;TAG1-APP信號通路在成體神經發(fā)生中的作用[D];昆明醫(yī)科大學;2017年

9 邵虹;青海沙蜥成體神經發(fā)生的特征描述[D];蘭州大學;2012年

10 郭萍敬;季節(jié)變化對青海沙蜥成體神經發(fā)生影響的研究[D];蘭州大學;2013年

本文編號：2680317