【摘要】：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族蛋白的受體蛋白。作為受體酪氨酸家族中的一員,FGFR在調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移及細(xì)胞存活等過(guò)程中發(fā)揮著重要功能,FGFR信號(hào)通路的異常將導(dǎo)致多種疾病或者發(fā)育綜合征的出現(xiàn)。FGFR位于細(xì)胞膜表面,其胞外端通過(guò)輔因子(肝素或klothos)結(jié)合配體,形成同源二聚復(fù)合體,引起胞內(nèi)激酶區(qū)不同酪氨酸磷酸化位點(diǎn)發(fā)生反式磷酸化反應(yīng),進(jìn)而活化下游的信號(hào)通路。FGFR胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域包含7個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn),其中位于活化環(huán)上的Y653和Y654具有酪氨酸激酶活性;其他酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化可以作為下游信號(hào)分子的結(jié)合位點(diǎn),從而活化特定的信號(hào)通路。FGFR是單次跨膜的酪氨酸受體,然而體外研究中膜環(huán)境模擬的挑戰(zhàn)性,限制了針對(duì)全長(zhǎng)膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究,導(dǎo)致絕大多數(shù)體外研究仍以局部結(jié)構(gòu)域作為研究對(duì)象。因此尋找合適的類膜環(huán)境,對(duì)深入探究全長(zhǎng)FGFR的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。在已知的多種類膜體系中,Nanodiscs是一種較為理想的體外類膜體系模型。Nanodiscs不僅含有雙層的磷脂結(jié)構(gòu),而且可以依據(jù)不同的研究目的,通過(guò)調(diào)控磷脂的比例及組成,精確地調(diào)控nanodiscs尺寸的大小;同時(shí)組裝后的復(fù)合物可以利用多種技術(shù)手段進(jìn)行表征及分析。該技術(shù)已被嘗試應(yīng)用于多個(gè)膜蛋白的結(jié)構(gòu)及功能研究中。本論文選擇與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)家族成員FGFR1 c,結(jié)合體外nanodiscs體系對(duì)其進(jìn)行了一系列的探究。研究?jī)?nèi)容主要包括兩部分:第一部分重點(diǎn)探究FGFR1c體外nanodiscs組裝的適宜條件,并對(duì)FGFR1c的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征和功能驗(yàn)證;第二部分利用peptide nanodiscs體系研究局部膜環(huán)境對(duì)FGFR1c胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域活性的調(diào)控作用。取得的主要研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建了 FGFR1c的昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系,表達(dá)并純化了全長(zhǎng)FGFR1c蛋白,利用MSPΔH5 nanodiscs體系實(shí)現(xiàn)了針對(duì)全長(zhǎng)FGFR1c及其配體復(fù)合物(bFGF/heparin/FGFR)的組裝,并對(duì)FGFR1c進(jìn)行生物冷凍電鏡的初步結(jié)構(gòu)表征和功能驗(yàn)證。2.利用peptide nanodiscs體系,通過(guò)調(diào)控磷脂與小肽的比例,實(shí)現(xiàn)了對(duì)nanodiscs尺寸的精確調(diào)控,并通過(guò)引入一定比例的DGS-NTA(Ni)磷脂將FGFR胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域(FGFR1K)錨定在類膜體系的表面,在類膜體系環(huán)境下對(duì)FGFR1K的活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
【圖文】：

第一章ＦＧＦＲ結(jié)構(gòu)域功能研宄進(jìn)展及類膜體系在膜蛋白研宄中的應(yīng)用白進(jìn)行分類，分為很多蛋白亞家族。目前，較為一致的觀點(diǎn)是將ＦＧＦ：５個(gè)旁分泌的亞家族，一個(gè)內(nèi)分泌的亞家族（ＦＧＦ１５／１９亞家族）在于細(xì)胞內(nèi)的ＦＧＦ亞家族（ＦＧＦ１１亞家族）。經(jīng)典的旁分泌的家族主幾個(gè)家族：ＦＧＦ１亞家族，ＦＧＦ４亞家族，ＦＧＦ７亞家族，ＦＧＦ８亞家邋亞家族（圖邋１．１）邋［４，邋１９－２１］。逡逑Ｃｏｆａｃｔｏｒ：邋Ｈｅｐａｒｉｎ／Ｈｅｐａｒａｎ邋ｓｕｌｆａｔｅ逡逑－一逡逑

邐邐逡逑因庫(kù)中得到的ｃＤＮＡ具有高度的同源性（９０－１００％是在激酶區(qū)），同時(shí)，ＦＬＧ邋—逡逑部分的ｃＤＮＡ的克隆，與大鼠中Ｂｅｋ中克隆的ｃＤＮＡ序列有８４％的基因同源性逡逑［６７］。Ｂｅｋ就是現(xiàn)在的ＦＧＦＲ２，同源基因的克隆促進(jìn)了邋ＦＧＦＲ３和ＦＧＦＲ４基因的逡逑發(fā)現(xiàn)［６８－７１］。逡逑１．２．１成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的結(jié)構(gòu)元件逡逑Ｎ端含有一個(gè)疏水的信號(hào)肽，三個(gè)胞外的免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)，一個(gè)胞內(nèi)的激逡逑酶結(jié)構(gòu)域，，由跨膜的螺旋區(qū)和近膜區(qū)連接起來(lái)。ＦＧＦＲ蛋白的胞外端有三個(gè)免疫逡逑球蛋白狀結(jié)構(gòu)域（ＤＩ，邋ＤＩＩ和ＤＩＩ），Ｎ端起始是一段２２氨基酸的信號(hào)肽，在逡逑ＤＩ和ＤＩＩ的連接處有一個(gè)酸盒（一段酸性的氨基酸序列），緊接著是ＤＩＩ和Ｄｉｌｉ逡逑結(jié)構(gòu)域（圖１．２）邋［７２－７４］。ＤＩＩ和Ｄｉｌｉ以及它們之間的連接區(qū)域決定了邋ＦＧＦＲ與逡逑配體結(jié)合的選擇性和特異性。ＤＩ和酸盒在胞外端作為自抑制的結(jié)構(gòu)存在，當(dāng)逡逑ＦＧＦＲ胞外端的ＤＩ和Ｉ－ＩＩ之間的連接區(qū)域被選擇性剪切掉之后，ＦＧＦＲ與相應(yīng)的逡逑ＦＧＦ的親和性得到了增強(qiáng)，這一現(xiàn)象印證了邋ＤＩ及其連接區(qū)域在配體結(jié)合過(guò)程中逡逑確實(shí)存在自抑制的作用［７５］。逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q78;R341

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本文編號(hào)：2676161