本文關(guān)鍵詞：重組sTNFα-RI蛋白同義密碼突變庫構(gòu)建、篩選及結(jié)構(gòu)優(yōu)化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腫瘤壞死因子-（TNF-）主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是介導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的一種重要炎癥因子。可溶性腫瘤壞死因子-（sTNF）為膜腫瘤壞死因子-的水解產(chǎn)物，在體內(nèi)以同源三聚體的活性形式存在。該細(xì)胞因子與滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上的相關(guān)受體（TNF-R,主要為TNF-RI和TNF-RII）結(jié)合，使這些細(xì)胞活化，產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、膠原酶、基膜溶解酶等，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步引發(fā)軟骨破壞和骨侵蝕。近十年來以sTNF為靶標(biāo)的生物藥物發(fā)展迅猛，2013年全球單一產(chǎn)品銷售額前10位的藥物中，以sTNF為靶標(biāo)的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物占有3位（Humira、Remicade、Enbrel），其中前兩位是TNF-的抗體類藥物，Enbrel為TNF-RII藥物。隨著這些藥物的應(yīng)用，臨床發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期給藥容易引起感染和腫瘤。此外，上述藥物采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO工程細(xì)胞表達(dá)，制備難度大，需要進(jìn)行糖基化等表達(dá)后修飾，質(zhì)量難以控制，且制造成本高，進(jìn)口藥物的平均售價(jià)2萬/支，難以惠及廣大患者，因此開發(fā)新型、高效、安全的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物成為當(dāng)前研發(fā)的焦點(diǎn)。 本研究以截短sTNF-RI重組蛋白（Sop55-2.6）為研究對(duì)象，以提高該蛋白包涵體產(chǎn)量及實(shí)現(xiàn)其可溶性表達(dá)為目標(biāo)，從基因水平和蛋白水平對(duì)該分子展開結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與優(yōu)化。論文涉及的主要內(nèi)容包括：（1）采用同義密碼突變庫構(gòu)建及篩選新技術(shù)，對(duì)目標(biāo)蛋白的全基因密碼進(jìn)行優(yōu)化，以提高該蛋白的包涵體產(chǎn)量。（2）應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)該蛋白序列的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行分析，從分子截短、表達(dá)載體、融合標(biāo)簽應(yīng)用、氨基酸突變及宿主方面展開設(shè)計(jì)與優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)Sop55-2.6蛋白的可溶性表達(dá)。 在同義密碼修飾研究方面，設(shè)計(jì)了同義密碼庫的簡(jiǎn)并引物，并對(duì)退火時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建了目標(biāo)基因完整的同義密碼突變庫，庫容達(dá)到1013；完成了445株克隆篩選，針對(duì)其中產(chǎn)量高于對(duì)照組的45株克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得42株基因序列不同但氨基酸序列未發(fā)生變化的克隆菌株，其同義密碼突變陽性率高達(dá)93%；進(jìn)一步放大培養(yǎng)驗(yàn)證后，成功篩選出包涵體收率及目標(biāo)蛋白相對(duì)百分含量明顯高于對(duì)照株的同義突變菌株，其每升發(fā)酵液的目標(biāo)蛋白總產(chǎn)量比對(duì)照株提高2.44倍。 在蛋白分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化方面，首先通過截短技術(shù)，去除C-端19個(gè)氨基酸，設(shè)計(jì)了Sop55-2.0蛋白，采用pET22b（+）載體實(shí)現(xiàn)原核細(xì)胞周質(zhì)腔可溶性表達(dá)，經(jīng)過初步純化分析發(fā)現(xiàn)，ELISA方法檢測(cè)的EC50值約為337.4g/ml；其次采用pET32a（+）載體，，通過Trx標(biāo)簽蛋白與Sop55-2.0蛋白偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)了該蛋白的融合可溶性表達(dá)，通過純化、EK酶酶切得到純度大于85%的Sop55-2.0蛋白，ELISA檢測(cè)其EC50值為154.6g/ml。為了進(jìn)一步提高截短蛋白的抗原結(jié)合力和可溶性，在Sop55-2.0結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，依據(jù)計(jì)算機(jī)分析切除N端17個(gè)氨基酸，獲得Sop55-2domain蛋白，并將Sop55-2.0、Sop55-2domain與Sop55-2.6蛋白在CHO細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了Fc結(jié)合的二倍體形式的可溶性表達(dá)，均獲得純度大于95%目標(biāo)蛋白，通過L929細(xì)胞學(xué)檢測(cè)表明：Sop55-2.6-Fc蛋白的比活接近于Sop55-2.6的比活值，而Sop55-2domain-Fc和Sop55-2.0-Fc未顯出明顯生物活性，由此確定Sop55-2.6的蛋白結(jié)構(gòu)為藥物開發(fā)的基本形式。為了繼續(xù)實(shí)現(xiàn)Sop55-2.6蛋白的可溶性表達(dá)，采用3×Flag融合標(biāo)簽，并將Sop55-2.6的氨基酸序列進(jìn)行多點(diǎn)突變，實(shí)現(xiàn)了Sop55-2.6分子在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性表達(dá)，可溶性目標(biāo)蛋白產(chǎn)量達(dá)到20%，ELISA初步檢測(cè)該融合蛋白的EC50為4.4g/ml，有關(guān)該可溶性蛋白的細(xì)胞學(xué)功效需展開進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。 本研究采用同義密碼庫構(gòu)建及篩選新技術(shù)，通過密碼偏性優(yōu)化篩選，提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。另一方面通過計(jì)算機(jī)輔助的結(jié)構(gòu)分析，從分子截短、表達(dá)載體、融合標(biāo)簽應(yīng)用、氨基酸突變及宿主方面展開設(shè)計(jì)與優(yōu)化，確定了Sop55-2.6序列作為藥物研發(fā)的基本序列，并實(shí)現(xiàn)該蛋白在E.coli細(xì)胞中的可溶性表達(dá)，為本品的新藥研發(fā)等提供了有力支持。課題采用的新技術(shù)和分子進(jìn)化的思路也為重組蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與優(yōu)化提供了有價(jià)值的參考。
【關(guān)鍵詞】：重組sTNF-RI 同義密碼突變庫 分子進(jìn)化 重組蛋白可溶性表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：四川抗菌素工業(yè)研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 1 前言12-17
• 1.1 腫瘤壞死因子12
• 1.2 腫瘤壞死因子受體12-13
• 1.3 治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物13-16
• 1.3.1 非甾體抗炎藥13-14
• 1.3.2 慢作用抗風(fēng)濕藥14
• 1.3.3 生物藥物14-16
• 1.4 藥物分子設(shè)計(jì)與優(yōu)化的研究進(jìn)展16
• 1.5 本論文的研究意義16-17
• 2 重組 sTNF -RI 蛋白同義密碼突變庫的構(gòu)建與篩選17-31
• 2.1 引言17-18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料18-19
• 2.2.1 質(zhì)粒與細(xì)胞株18
• 2.2.2 主要試劑與耗材18
• 2.2.3 試劑配制18-19
• 2.2.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器19
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法19-24
• 2.3.0 同義密碼突變庫模板19-20
• 2.3.1 同義密碼突變庫引物設(shè)計(jì)20-21
• 2.3.2 同義密碼突變庫的構(gòu)建21-22
• 2.3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建22
• 2.3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的電擊轉(zhuǎn)化22-23
• 2.3.5 菌落 PCR 檢測(cè)陽性單克隆23
• 2.3.6 陽性菌的誘導(dǎo)表達(dá)23
• 2.3.7 目標(biāo)蛋白的 dot blot 分析23-24
• 2.3.8 同義突變菌的小試培養(yǎng)驗(yàn)證24
• 2.3.9 放大培養(yǎng)及蛋白產(chǎn)量驗(yàn)證24
• 2.4 結(jié)果與分析24-30
• 2.4.1 載體的準(zhǔn)備24-25
• 2.4.2 同義密碼突變庫的裝配25-26
• 2.4.3 同義密碼突變庫測(cè)序及庫容計(jì)算26
• 2.4.4 同義密碼突變庫的酶切26-27
• 2.4.5 克隆菌落 PCR 鑒定27-28
• 2.4.6 Dot blotting 分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)結(jié)果28
• 2.4.7 同義突變菌株的測(cè)序結(jié)果28-29
• 2.4.8 克隆菌表達(dá)的小試驗(yàn)證29-30
• 2.4.9 蛋白產(chǎn)量的放大驗(yàn)證30
• 2.5 小結(jié)與討論30-31
• 3 蛋白可溶性表達(dá)分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化31-58
• 3.1 引言31-33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料33-36
• 3.2.1 載體與細(xì)胞株33-34
• 3.2.2 主要試劑34-35
• 3.2.3 試劑配制35-36
• 3.2.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器36
• 3.3 方法36-44
• 3.3.1 引物設(shè)計(jì)36-37
• 3.3.2 Sop55-2.0 基因序列的擴(kuò)增37
• 3.3.3 Sop55-2.0 基因與載體的酶切與回收37-38
• 3.3.4 基因的連接與轉(zhuǎn)化38-39
• 3.3.5 克隆菌落 PCR 鑒定39
• 3.3.6 陽性克隆菌的表達(dá)及樣品準(zhǔn)備39-40
• 3.3.7 Western Blot 檢測(cè)40
• 3.3.8 蛋白樣品純化40-41
• 3.3.9 ELISA 檢測(cè)親和力活性41-42
• 3.3.10 CHO 細(xì)胞表達(dá)結(jié)構(gòu)形式的構(gòu)建42
• 3.3.11 基于 L929 細(xì)胞的的生物活性檢測(cè)42-43
• 3.3.12 融合標(biāo)簽及氨基酸突變優(yōu)化 Sop55-2.6 蛋白可溶性表達(dá)43-44
• 3.4 結(jié)果與分析44-57
• 3.4.1 原核表達(dá)載體及 Sop55-2.0 分子基因的準(zhǔn)備44-45
• 3.4.2 克隆菌的菌落 PCR 驗(yàn)證45-46
• 3.4.3 WB 檢測(cè)結(jié)果46-48
• 3.4.4 Sop55-2.0 蛋白純化及檢測(cè)48-50
• 3.4.5 ELISA 親和力檢測(cè)50-52
• 3.4.6 CHO 表達(dá)蛋白與原蛋白電泳結(jié)果對(duì)比52-54
• 3.4.7 生物活性測(cè)定結(jié)果54-55
• 3.4.8 融合標(biāo)簽及氨基酸突變優(yōu)化結(jié)果55-57
• 3.5 小結(jié)與討論57-58
• 4 結(jié)論與展望58-60
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 致謝65
• 作者在讀期間科研成果簡(jiǎn)介65-66
• 綜述：氨基酸同義密碼子研究進(jìn)展66-72
• 參考文獻(xiàn)70-72

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：重組sTNFα-RI蛋白同義密碼突變庫構(gòu)建、篩選及結(jié)構(gòu)優(yōu)化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：267247