發(fā)布時間：2017-03-25 13:10

  本文關(guān)鍵詞：重組sTNFα-RI蛋白同義密碼突變庫構(gòu)建、篩選及結(jié)構(gòu)優(yōu)化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腫瘤壞死因子-（TNF-）主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生，是介導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的一種重要炎癥因子�？扇苄阅[瘤壞死因子-（sTNF）為膜腫瘤壞死因子-的水解產(chǎn)物，在體內(nèi)以同源三聚體的活性形式存在。該細胞因子與滑膜細胞、巨噬細胞、軟骨細胞和破骨細胞上的相關(guān)受體（TNF-R,主要為TNF-RI和TNF-RII）結(jié)合，使這些細胞活化，產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、膠原酶、基膜溶解酶等，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)，進一步引發(fā)軟骨破壞和骨侵蝕。近十年來以sTNF為靶標的生物藥物發(fā)展迅猛，2013年全球單一產(chǎn)品銷售額前10位的藥物中，以sTNF為靶標的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物占有3位（Humira、Remicade、Enbrel），其中前兩位是TNF-的抗體類藥物，Enbrel為TNF-RII藥物。隨著這些藥物的應(yīng)用，臨床發(fā)現(xiàn)長期給藥容易引起感染和腫瘤。此外，上述藥物采用哺乳動物細胞如CHO工程細胞表達，制備難度大，需要進行糖基化等表達后修飾，質(zhì)量難以控制，且制造成本高，進口藥物的平均售價2萬/支，難以惠及廣大患者，因此開發(fā)新型、高效、安全的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物成為當前研發(fā)的焦點。 本研究以截短sTNF-RI重組蛋白（Sop55-2.6）為研究對象，以提高該蛋白包涵體產(chǎn)量及實現(xiàn)其可溶性表達為目標，從基因水平和蛋白水平對該分子展開結(jié)構(gòu)設(shè)計與優(yōu)化。論文涉及的主要內(nèi)容包括：（1）采用同義密碼突變庫構(gòu)建及篩選新技術(shù)，對目標蛋白的全基因密碼進行優(yōu)化，以提高該蛋白的包涵體產(chǎn)量。（2）應(yīng)用計算機軟件對該蛋白序列的構(gòu)效關(guān)系進行分析，從分子截短、表達載體、融合標簽應(yīng)用、氨基酸突變及宿主方面展開設(shè)計與優(yōu)化，以實現(xiàn)Sop55-2.6蛋白的可溶性表達。 在同義密碼修飾研究方面，設(shè)計了同義密碼庫的簡并引物，并對退火時間進行優(yōu)化，構(gòu)建了目標基因完整的同義密碼突變庫，庫容達到1013；完成了445株克隆篩選，針對其中產(chǎn)量高于對照組的45株克隆進行測序，獲得42株基因序列不同但氨基酸序列未發(fā)生變化的克隆菌株，其同義密碼突變陽性率高達93%；進一步放大培養(yǎng)驗證后，成功篩選出包涵體收率及目標蛋白相對百分含量明顯高于對照株的同義突變菌株，其每升發(fā)酵液的目標蛋白總產(chǎn)量比對照株提高2.44倍。 在蛋白分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化方面，首先通過截短技術(shù)，去除C-端19個氨基酸，設(shè)計了Sop55-2.0蛋白，采用pET22b（+）載體實現(xiàn)原核細胞周質(zhì)腔可溶性表達，經(jīng)過初步純化分析發(fā)現(xiàn)，ELISA方法檢測的EC50值約為337.4g/ml；其次采用pET32a（+）載體，，通過Trx標簽蛋白與Sop55-2.0蛋白偶聯(lián)實現(xiàn)了該蛋白的融合可溶性表達，通過純化、EK酶酶切得到純度大于85%的Sop55-2.0蛋白，ELISA檢測其EC50值為154.6g/ml。為了進一步提高截短蛋白的抗原結(jié)合力和可溶性，在Sop55-2.0結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，依據(jù)計算機分析切除N端17個氨基酸，獲得Sop55-2domain蛋白，并將Sop55-2.0、Sop55-2domain與Sop55-2.6蛋白在CHO細胞中實現(xiàn)了Fc結(jié)合的二倍體形式的可溶性表達，均獲得純度大于95%目標蛋白，通過L929細胞學(xué)檢測表明：Sop55-2.6-Fc蛋白的比活接近于Sop55-2.6的比活值，而Sop55-2domain-Fc和Sop55-2.0-Fc未顯出明顯生物活性，由此確定Sop55-2.6的蛋白結(jié)構(gòu)為藥物開發(fā)的基本形式。為了繼續(xù)實現(xiàn)Sop55-2.6蛋白的可溶性表達，采用3×Flag融合標簽，并將Sop55-2.6的氨基酸序列進行多點突變，實現(xiàn)了Sop55-2.6分子在細胞質(zhì)內(nèi)的可溶性表達，可溶性目標蛋白產(chǎn)量達到20%，ELISA初步檢測該融合蛋白的EC50為4.4g/ml，有關(guān)該可溶性蛋白的細胞學(xué)功效需展開進一步的評價。 本研究采用同義密碼庫構(gòu)建及篩選新技術(shù)，通過密碼偏性優(yōu)化篩選，提高目標蛋白的表達產(chǎn)量。另一方面通過計算機輔助的結(jié)構(gòu)分析，從分子截短、表達載體、融合標簽應(yīng)用、氨基酸突變及宿主方面展開設(shè)計與優(yōu)化，確定了Sop55-2.6序列作為藥物研發(fā)的基本序列，并實現(xiàn)該蛋白在E.coli細胞中的可溶性表達，為本品的新藥研發(fā)等提供了有力支持。課題采用的新技術(shù)和分子進化的思路也為重組蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計與優(yōu)化提供了有價值的參考。
【關(guān)鍵詞】：重組sTNF-RI 同義密碼突變庫 分子進化 重組蛋白可溶性表達
【學(xué)位授予單位】：四川抗菌素工業(yè)研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 1 前言12-17
• 1.1 腫瘤壞死因子12
• 1.2 腫瘤壞死因子受體12-13
• 1.3 治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物13-16
• 1.3.1 非甾體抗炎藥13-14
• 1.3.2 慢作用抗風(fēng)濕藥14
• 1.3.3 生物藥物14-16
• 1.4 藥物分子設(shè)計與優(yōu)化的研究進展16
• 1.5 本論文的研究意義16-17
• 2 重組 sTNF -RI 蛋白同義密碼突變庫的構(gòu)建與篩選17-31
• 2.1 引言17-18
• 2.2 實驗試劑及材料18-19
• 2.2.1 質(zhì)粒與細胞株18
• 2.2.2 主要試劑與耗材18
• 2.2.3 試劑配制18-19
• 2.2.4 主要實驗儀器19
• 2.3 實驗方法19-24
• 2.3.0 同義密碼突變庫模板19-20
• 2.3.1 同義密碼突變庫引物設(shè)計20-21
• 2.3.2 同義密碼突變庫的構(gòu)建21-22
• 2.3.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建22
• 2.3.4 重組表達質(zhì)粒的電擊轉(zhuǎn)化22-23
• 2.3.5 菌落 PCR 檢測陽性單克隆23
• 2.3.6 陽性菌的誘導(dǎo)表達23
• 2.3.7 目標蛋白的 dot blot 分析23-24
• 2.3.8 同義突變菌的小試培養(yǎng)驗證24
• 2.3.9 放大培養(yǎng)及蛋白產(chǎn)量驗證24
• 2.4 結(jié)果與分析24-30
• 2.4.1 載體的準備24-25
• 2.4.2 同義密碼突變庫的裝配25-26
• 2.4.3 同義密碼突變庫測序及庫容計算26
• 2.4.4 同義密碼突變庫的酶切26-27
• 2.4.5 克隆菌落 PCR 鑒定27-28
• 2.4.6 Dot blotting 分析目標蛋白的表達結(jié)果28
• 2.4.7 同義突變菌株的測序結(jié)果28-29
• 2.4.8 克隆菌表達的小試驗證29-30
• 2.4.9 蛋白產(chǎn)量的放大驗證30
• 2.5 小結(jié)與討論30-31
• 3 蛋白可溶性表達分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化31-58
• 3.1 引言31-33
• 3.2 實驗試劑及材料33-36
• 3.2.1 載體與細胞株33-34
• 3.2.2 主要試劑34-35
• 3.2.3 試劑配制35-36
• 3.2.4 主要實驗儀器36
• 3.3 方法36-44
• 3.3.1 引物設(shè)計36-37
• 3.3.2 Sop55-2.0 基因序列的擴增37
• 3.3.3 Sop55-2.0 基因與載體的酶切與回收37-38
• 3.3.4 基因的連接與轉(zhuǎn)化38-39
• 3.3.5 克隆菌落 PCR 鑒定39
• 3.3.6 陽性克隆菌的表達及樣品準備39-40
• 3.3.7 Western Blot 檢測40
• 3.3.8 蛋白樣品純化40-41
• 3.3.9 ELISA 檢測親和力活性41-42
• 3.3.10 CHO 細胞表達結(jié)構(gòu)形式的構(gòu)建42
• 3.3.11 基于 L929 細胞的的生物活性檢測42-43
• 3.3.12 融合標簽及氨基酸突變優(yōu)化 Sop55-2.6 蛋白可溶性表達43-44
• 3.4 結(jié)果與分析44-57
• 3.4.1 原核表達載體及 Sop55-2.0 分子基因的準備44-45
• 3.4.2 克隆菌的菌落 PCR 驗證45-46
• 3.4.3 WB 檢測結(jié)果46-48
• 3.4.4 Sop55-2.0 蛋白純化及檢測48-50
• 3.4.5 ELISA 親和力檢測50-52
• 3.4.6 CHO 表達蛋白與原蛋白電泳結(jié)果對比52-54
• 3.4.7 生物活性測定結(jié)果54-55
• 3.4.8 融合標簽及氨基酸突變優(yōu)化結(jié)果55-57
• 3.5 小結(jié)與討論57-58
• 4 結(jié)論與展望58-60
• 參考文獻60-65
• 致謝65
• 作者在讀期間科研成果簡介65-66
• 綜述：氨基酸同義密碼子研究進展66-72
• 參考文獻70-72

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：重組sTNFα-RI蛋白同義密碼突變庫構(gòu)建、篩選及結(jié)構(gòu)優(yōu)化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：267247