本文關(guān)鍵詞：Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗的制備及其對(duì)損傷脊髓的免疫治療研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)后由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)難以恢復(fù)而造成部分或大部分器官功能的缺失,以致出現(xiàn)四肢癱瘓甚至各種器官功能喪失。因此這類疾病的治療需要高昂的治療和護(hù)理費(fèi)用,給家庭和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和精神壓力。成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)經(jīng)損傷后,中樞神經(jīng)纖維難以再生且難以進(jìn)行自我修復(fù),但是外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)纖維損傷之后卻能夠自我修復(fù)并恢復(fù)其相應(yīng)的運(yùn)動(dòng)功能,主要因?yàn)閮煞N神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維所存在的微環(huán)境不同。中樞神經(jīng)微環(huán)境中存在多種髓磷脂相關(guān)抑制因子(Myelin associated inhibitors,MAIs),在脊髓損傷早期他們會(huì)抑制軸突的再生和后期則促進(jìn)膠質(zhì)瘢痕的形成。因此通過改善中樞微環(huán)境以達(dá)到干預(yù)抑制信號(hào)傳遞,促進(jìn)神經(jīng)軸突再生,可能是針對(duì)脊髓損傷行之有效的治療方法之一。作為一種重要的MAIs,Nogo蛋白主要通過Nogo-66、Amino-Nogo兩個(gè)功能域參與下游多種受體介導(dǎo)的軸突再生抑制效應(yīng),因此以這兩個(gè)區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn),阻斷抑制信號(hào)傳遞,可能會(huì)有效促進(jìn)神經(jīng)突的再生和保護(hù)神經(jīng)元生長錐的完整;核酸疫苗作為一種新的免疫治療策略近年來已被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療研究,這種技術(shù)主要由于成本低,應(yīng)用前景廣等多種優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注;人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GMCSF)具有增強(qiáng)免疫應(yīng)答和促進(jìn)T細(xì)胞增殖的能力,是一種重要的佐劑因子。GMCSF還具有神經(jīng)保護(hù)作用,可激活神經(jīng)干、祖細(xì)胞且抑制膠質(zhì)瘢痕的形成。本實(shí)驗(yàn)采用基因工程方法分別克隆Nogo-66、Amino-Nogo和GM-CSF基因片段,構(gòu)建Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗。體內(nèi)觀察該免疫治療策略是否能夠有效地產(chǎn)生Nogo蛋白,進(jìn)而利用機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生Nogo抗體,抑制髓磷脂相關(guān)抑制信號(hào)的傳遞。利用行為學(xué)、組織學(xué)等方法體外觀察Nogo-GMCSF核酸疫苗是否有助于中樞軸突再生和動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù),為脊髓損傷的免疫治療研究提供實(shí)踐基礎(chǔ)。主要技術(shù)路線:1.載體的構(gòu)建、鑒定及表達(dá)檢測將PCR擴(kuò)增的GMCSF、Amino-Nogo及Nogo-66三個(gè)目的片段,分別亞克隆至pc DNA3.1(+)質(zhì)粒中,構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66,并進(jìn)行PCR、酶切及基因測序鑒定。脂質(zhì)體法將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)細(xì)胞后采用免疫熒光和Western-blot法檢測其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。2.Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗的制備將重組質(zhì)粒pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66轉(zhuǎn)化于E.coli DH5α后,大量擴(kuò)增并收集無內(nèi)毒素的高濃度質(zhì)粒;以脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒,按不同體積比(2:1、1:1、1:2)混勻得到Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗制劑。用遠(yuǎn)交群(Sprague Dawley,SD)大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,肌肉注射免疫制備的核酸疫苗,每周免疫一次,持續(xù)免疫6w,每周跟蹤檢測各組核酸疫苗所產(chǎn)生的抗體滴度,以獲得最佳免疫制劑。3.Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗的免疫學(xué)及脊髓損傷治療效果評(píng)價(jià)用最佳免疫制劑免疫大鼠,每周一次,持續(xù)免疫6w,在此期間觀察動(dòng)物的體重、毛發(fā)等指標(biāo)評(píng)價(jià)該疫苗是否會(huì)引起自身免疫反應(yīng)而導(dǎo)致變態(tài)腦脊髓炎的發(fā)生,并且每免疫一次之后一周檢測動(dòng)物血清的抗體效價(jià)。6w免疫完畢之后1周,制備脊髓左側(cè)半橫切損傷模型,對(duì)各組損傷脊髓的恢復(fù)情況進(jìn)行行為學(xué)、組織學(xué)、分子水平等方面的評(píng)價(jià),觀察Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗對(duì)脊髓損傷的治療修復(fù)效果以及軸突再生情況。4.外源基因整合情況檢測Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗免疫6w之后,每周對(duì)免疫的動(dòng)物取材,分別提取心、肝、脾、肺、腎、腦、脊髓以及注射部位肌肉組織的DNA,以提取的DNA為模板PCR法檢測重組質(zhì)粒目的片段整合基因組的情況。主要結(jié)果及結(jié)論:1.陽性克隆PCR、酶切鑒定和基因測序結(jié)果表明成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66,免疫熒光和Western blot檢測結(jié)果表明該質(zhì)粒能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)具有生物學(xué)活性的Nogo-GMCSF融合蛋白。2.用脂質(zhì)體為免疫佐劑制備Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗,通過血清抗體效價(jià)檢測獲得脂質(zhì)體與重組質(zhì)粒pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66的最佳體積比為1:1。3.成功制備Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗制劑,免疫動(dòng)物,并在免疫期間檢測動(dòng)物檢測各組動(dòng)物血清的抗體效價(jià),發(fā)現(xiàn)Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗能夠在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生有效的抗體,GMCSF作為免疫佐劑因子能夠有效增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)。4.成功制備脊髓左側(cè)半橫切損傷模型,中樞神經(jīng)功能評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn):Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗能夠促進(jìn)左后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)及修復(fù)受損的脊髓;行為學(xué)、組織學(xué)、分子水平的檢測結(jié)果表明Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗接種產(chǎn)生的抗體,能夠有效封閉Nogo蛋白的兩個(gè)主要功能區(qū)域,阻斷由Nogo介導(dǎo)的抑制神經(jīng)再生相關(guān)信號(hào)的傳遞,進(jìn)而促進(jìn)受損脊髓修復(fù)和運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)。5.重組質(zhì)粒pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66整合基因組檢測結(jié)果表明,連續(xù)免疫6周后,在最后一次免疫后第6周檢測重組質(zhì)粒基因片段整合到動(dòng)物基因組的情況,PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍為陰性,所以該核酸疫苗不存在外源基因整合到動(dòng)物基因組的情況。
【關(guān)鍵詞】：Nogo GMCSF 核酸疫苗 脊髓損傷 軸突再生
【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.2;R392
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 英文縮寫標(biāo)注10-14
• 緒論14-21
• 1 髓磷脂相關(guān)抑制因子Nogo14-18
• 2 GMCSF在免疫應(yīng)答及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中的作用18-19
• 3 核酸疫苗在脊髓損傷免疫治療中的應(yīng)用19-21
• 第一章真核表達(dá)載體pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66的構(gòu)建與鑒定21-46
• 1 實(shí)驗(yàn)材料21-26
• 1.1 載體21
• 1.2 菌株21
• 1.3 細(xì)胞系21
• 1.4 主要試劑21-22
• 1.5 引物合成和DNA序列測定22-23
• 1.6 主要實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 1.7 主要試劑配制24-26
• 2 實(shí)驗(yàn)方法26-39
• 2.1 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞制備26-27
• 2.2 真核表達(dá)載體pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66的構(gòu)建27-36
• 2.3 真核表達(dá)載體pc DNA-GNCSF-Nogo N-Nogo66鑒定36-39
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-45
• 3.1 目的基因擴(kuò)增39-41
• 3.2 陽性克隆鑒定41-44
• 3.3 重組質(zhì)粒pc DNA-GMCSF-Nogo N-Nogo66的體外表達(dá)檢測44-45
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析45-46
• 第二章 Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗對(duì)脊髓損傷免疫治療效果評(píng)價(jià)46-80
• 1 實(shí)驗(yàn)材料46-50
• 1.1 質(zhì)粒46
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物46
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器46-47
• 1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑47-48
• 1.5 主要實(shí)驗(yàn)試劑配制48-50
• 2 實(shí)驗(yàn)方法50-64
• 2.1 Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗的制備50-51
• 2.2 疫苗制劑確定51-52
• 2.3 Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗免疫動(dòng)物52
• 2.4 Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗體內(nèi)抗體效價(jià)檢測52-53
• 2.5 SD大鼠變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎發(fā)生率檢測53
• 2.6 動(dòng)物模型的制備53-54
• 2.7 行為學(xué)方法評(píng)價(jià)Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗對(duì)脊髓損傷的治療效果54-56
• 2.8 組織學(xué)方法評(píng)價(jià)Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗對(duì)脊髓損傷的治療效果56-60
• 2.9 Nogo在免疫部位肌肉組織的表達(dá)60-61
• 2.10 免疫組化檢測脊髓Nogo與GAP-43的表達(dá)61-62
• 2.11 Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗體內(nèi)外源基因整合情況檢測62-63
• 2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析63-64
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果64-79
• 3.1 Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗免疫條件確定64
• 3.2 Nogo在免疫部位肌肉組織的表達(dá)情況64-65
• 3.3 Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗產(chǎn)生的抗體效價(jià)65-66
• 3.4 行為學(xué)檢測結(jié)果66-71
• 3.5 組織學(xué)檢測結(jié)果71-74
• 3.6 免疫組化檢測74-76
• 3.7 變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的發(fā)生率76-77
• 3.8 外源基因整合情況檢測結(jié)果77-79
• 4 結(jié)論79-80
• 討論80-83
• 全文總結(jié)83-84
• 參考文獻(xiàn)84-89
• 致謝89-90
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及取得的研究成果90

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳開廷;王永堂;舒亞海;肖嵐;魯秀敏;;以髓磷脂相關(guān)抑制因子及其受體為靶點(diǎn)的脊髓損傷免疫治療策略研究[J];生命科學(xué);2015年02期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 鄒蘇琪;成年斑馬魚視神經(jīng)損傷后軸突再生與髓鞘再建的研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

2 霍妍;Nogo氨基末端在視神經(jīng)再生中的作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉寧;嗅鞘細(xì)胞移植治療大鼠馬尾神經(jīng)壓迫損傷的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

2 胡婧楠;軸突生長抑制蛋白在聽覺剝奪大鼠聽皮層中的表達(dá)及其對(duì)聽皮層可塑性調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：Nogo-GMCSF復(fù)合核酸疫苗的制備及其對(duì)損傷脊髓的免疫治療研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：266043