本文關(guān)鍵詞：4b型單核細胞增生李斯特菌InlF蛋白的致病機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是重要的食源性人獸共患李斯特菌病的病原菌。在其多種毒力因子的作用下,Lm能突破宿主的腸道屏障、血胎屏障和血腦屏障進行擴散和傳播,所引發(fā)的感染具有較高死亡率。在Lm感染宿主的過程中,能憑借其獨特的表面蛋白入侵宿主的吞噬細胞及多種非吞噬細胞,并在胞內(nèi)存活和增殖。內(nèi)化素蛋白家族是其中一類重要的毒力因子,Lm的黏附侵襲作用與其多種內(nèi)化素蛋白密切相關(guān),InlF蛋白為內(nèi)化素家族成員,其氨基酸序列在臨床腦膜炎型分離株和食品及環(huán)境分離株間差異較大,但迄今為止尚未對其功能特性進行深入研究。本文以從暴發(fā)李斯特菌病的綿羊腦內(nèi)分離的血清型4b的Lm NTSN菌株的InlF蛋白為研究對象,以多種非吞噬細胞及小鼠和豚鼠為實驗模型,深入研究4b型菌株InlF蛋白的致病作用,為揭示Lm致病機理提供了新認識。1 Lm內(nèi)化素家族基因體內(nèi)外感染條件下轉(zhuǎn)錄表達特性以5種非吞噬細胞(人結(jié)直腸腺癌細胞系Caco-2、人肝癌細胞系HepG2、人腦內(nèi)皮細胞HBMEC、鼠肝細胞系BRL3A、鼠成纖維細胞系NIH3T3)為體外感染模型,BALB/c小鼠和豚鼠為體內(nèi)感染模型,利用實時熒光定量PCR的方法對LmNTSN體內(nèi)外感染后的9種內(nèi)化素基因(inlA、inlB、inlC、inlC2、inlD、inlF、inlI、inlJ、vip)的轉(zhuǎn)錄表達特性進行研究。結(jié)果顯示,在體外感染條件下,除HBMEC細胞外,Lm感染非吞噬細胞系后其inlF、inlI、inlJ、vip基因均顯著上調(diào)表達；在體內(nèi)口服感染條件下,內(nèi)化素基因在小鼠及豚鼠脾臟和肝臟中的相對轉(zhuǎn)錄水平趨勢一致；大腦中內(nèi)化素基因的轉(zhuǎn)錄表達存在差異,其中inlF、inlI、vip基因僅在豚鼠腦組織中顯著性上調(diào)。以上結(jié)果提示,除小鼠腦組織外,inlF基因在Lm體內(nèi)外感染中發(fā)揮重要作用；此外,還預示4b型Lm感染小鼠和豚鼠的致病機制存在一定的差異。2 LmNTSN內(nèi)化素蛋白InlF的生物信息學分析及原核表達本研究對LmNTSN的inlF基因進行了克隆,并對其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行了生物學信息預測。結(jié)果顯示,InlF蛋白是一個含有亮氨酸重復區(qū)域(LRRs)和LPXTG結(jié)構(gòu)的細胞壁表面蛋白,其N末端含有長為35個氨基酸的信號肽序列,13個LRRs序列在蛋白的高級構(gòu)象上內(nèi)凹形成口袋狀,與內(nèi)化素InlA蛋白結(jié)構(gòu)相似,C末端的LPXTG結(jié)構(gòu)可被轉(zhuǎn)肽酶A (StrA)識別切割并共價結(jié)合于細胞壁磷壁酸。利用MEGA5軟件對InlF氨基酸序列進行分析,結(jié)果顯示LmNTSN的InlF蛋白與譜系Ⅰ中菌株的InlF蛋白高度同源,而譜系Ⅰ、Ⅱ中菌株的InlF蛋白同源性較低(78%)。利用低溫表達載體pCold成功地表達了InlF蛋白,SDS-PAGE結(jié)果顯示,40kDa的目標蛋白以包涵體的形式存在。以弗氏佐劑聯(lián)合InlF蛋白皮下免疫BALB/c小鼠,用間接ELISA方法對InlF蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的抗InlF血清IgG效價測定結(jié)果顯示,血清效價為1：800。InlF蛋白的生物信息學預測為其功能研究提供了依據(jù),該蛋白的原核表達和多抗的制備為其功能研究提供了生物材料。3 LmNTSN △inlF缺失株的構(gòu)建及其生物學特性的研究利用同源重組技術(shù)成功地構(gòu)建了inlF基因的缺失突變株LmNTSN △inlF,以五種非吞噬細胞系為體外感染模型、小鼠和豚鼠為體內(nèi)感染模型,對其功能進行了研究。RT-PCR試驗結(jié)果表明,缺失突變株中的inlF基因不能有效轉(zhuǎn)錄；提取LmNTSN △inlF的菌體蛋白進行Western blot分析,結(jié)果顯示抗InlF的多克隆抗體未檢測到大小為88kDa的靶蛋白,從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平證明inlF基因已成功從NTSN基因組中敲除。缺失突變株LmNTSN△inlF的生長曲線、生理生化特性結(jié)果顯示,inlF基因缺失突變株在BHI液體培養(yǎng)基中的生長及代謝特性與野生株相比無顯著性差異。選用五種人源和鼠源的非吞噬細胞(人結(jié)直腸腺癌細胞系Caco-2、人肝癌細胞系HepG2、人腦內(nèi)皮細胞HBMEC、鼠肝細胞系BRL3A、鼠成纖維細胞系NIH3T3)為體外感染模型進行細胞黏附、侵襲實驗。結(jié)果顯示,△inlF缺失株對細胞黏附侵襲的能力與野生株相比無顯著差異。選取小鼠小腸為體外、體內(nèi)感染模型,對InlF在早期感染中的作用進行測定。結(jié)果顯示,在體外和體內(nèi)感染小腸1h時,△inlF缺失株對腸道黏附能力均顯著低于野生株(P0.05)；在體內(nèi)感染3h和5h時,△inlF缺失株分別在派伊爾氏結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中定植,且其在腸系膜淋巴結(jié)中的載菌量與野生株之間存在顯著性差異(P0.05),由此表明InlF蛋白在Lm感染早期的黏附和定植過程中發(fā)揮作用。此外,以小鼠和豚鼠為體內(nèi)口服感染模型,對inlF缺失株在體內(nèi)的感染動態(tài)、組織分布和病理變化進行了測定。結(jié)果顯示,在小鼠口服感染4h時,△inlF缺失株在肝臟中的定植數(shù)量顯著低于野生株(P0.05),而脾臟、小腸、腸系膜淋巴結(jié)中的載菌量與野生株相比無明顯差異；在后期感染中,△inlF與野生株在這些內(nèi)臟中的定植數(shù)量無顯著差異�？诜腥倦嗍�6h后,△inlF缺失株在脾臟、肝臟中的定植能力顯著降低(P0.01,P0.05)；感染24h后,在脾臟、肝臟中的增殖能力均極顯著低于野生株(P0.001)。病理切片結(jié)果顯示△inlF缺失株對豚鼠的毒力明顯低于野生株。由此可知,與小鼠感染模型相比,In1F蛋白在Lm感染豚鼠后突破腸道屏障并在脾臟、肝臟中的定植和致病中發(fā)揮更加重要的作用。綜上所述,對譜系Ⅰ的4b型菌株LmNTSN的InlF蛋白功能研究結(jié)果表明,InlF蛋白對Lm突破小鼠和豚鼠腸道屏障過程中的早期黏附、侵入及在肝臟中的定植發(fā)揮重要作用；對Lm口服感染豚鼠后在肝臟和脾臟中定植的作用強于對小鼠的感染和致病作用,表明InlF蛋白是4b型菌株NTSN的重要毒力因子,本研究為探索InlF蛋白在Lm感染宿主中突破腸道屏障和血腦屏障的機制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：單核細胞增生李斯特菌 InlF蛋白 血清型4b 突變株 小鼠 豚鼠 非吞噬細胞
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61;R378
【目錄】：

• 中文摘要2-5
• Abstract5-8
• 符號說明8-11
• 綜述 單核細胞增生李斯特菌致病機制研究進展11-23
• 一、單核細胞增生李斯特菌的內(nèi)化素家族及其作用機制11-15
• 二、單核細胞增生李斯特菌其他毒力因子及其作用機制15-16
• 三、單核細胞增生李斯特菌突破宿主三大屏障的作用機制16-18
• 四、動物感染模型18
• 五、總結(jié)18-19
• 參考文獻19-23
• 第一章 體內(nèi)外感染條件下Lm內(nèi)化素基因轉(zhuǎn)錄表達特性23-36
• 1 材料與方法23-26
• 1.1 材料23-24
• 1.2 方法24-26
• 2 結(jié)果26-32
• 2.1 熒光定量PCR檢測Lm侵襲細胞系時內(nèi)化素基因的表達差異26-29
• 2.2 LmNTSN感染小鼠時內(nèi)化素基因的轉(zhuǎn)錄表達水平29-30
• 2.3 LmNTSN感染豚鼠時內(nèi)化素基因的轉(zhuǎn)錄表達水平30-32
• 3 討論32-34
• 參考文獻34-36
• 第二章 LmNTSN內(nèi)化素蛋白InlF的生物信息學分析及原核表達36-50
• 1 材料與方法36-40
• 1.1 材料36-37
• 1.2 方法37-40
• 2 結(jié)果40-46
• 2.1 單核細胞增生李斯特菌NTSN InlF蛋白生物信息學預測40-43
• 2.2 Lm菌株InlF蛋白氨基酸序列比較結(jié)果43-45
• 2.3 InlF蛋白的原核表達和多抗制備45-46
• 3 討論46-47
• 參考文獻47-50
• 第三章 LmNTSN△inlF缺失株的構(gòu)建及其生物學特性的研究50-71
• 1 材料與方法50-55
• 1.1 材料50-51
• 1.2 方法51-55
• 2 結(jié)果55-66
• 2.1 LmNTSN inlF基因缺失株的構(gòu)建55-58
• 2.2 LmNTSN△inlF生理生化特性測定58-59
• 2.3 Lm對非吞噬細胞系的黏附侵襲實驗59-61
• 2.4 Lm對小鼠毒力的測定61-62
• 2.5 Lm對小鼠腸道的早期感染試驗62-63
• 2.6 Lm對BALB/c小鼠的感染63-64
• 2.7 Lm對豚鼠的感染64-65
• 2.8 豚鼠感染后組織病理切片分析65-66
• 3 討論66-68
• 參考文獻68-71
• 全文總結(jié)71-72
• 致謝72-73
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學術(shù)論文73-74

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 趙丹;4b型單核細胞增生李斯特菌InlF蛋白的致病機制研究[D];揚州大學;2015年

  本文關(guān)鍵詞：4b型單核細胞增生李斯特菌InlF蛋白的致病機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：264877