發(fā)布時(shí)間：2017-03-24 01:13

  本文關(guān)鍵詞：4b型單核細(xì)胞增生李斯特菌InlF蛋白的致病機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是重要的食源性人獸共患李斯特菌病的病原菌。在其多種毒力因子的作用下,Lm能突破宿主的腸道屏障、血胎屏障和血腦屏障進(jìn)行擴(kuò)散和傳播,所引發(fā)的感染具有較高死亡率。在Lm感染宿主的過(guò)程中,能憑借其獨(dú)特的表面蛋白入侵宿主的吞噬細(xì)胞及多種非吞噬細(xì)胞,并在胞內(nèi)存活和增殖。內(nèi)化素蛋白家族是其中一類重要的毒力因子,Lm的黏附侵襲作用與其多種內(nèi)化素蛋白密切相關(guān),InlF蛋白為內(nèi)化素家族成員,其氨基酸序列在臨床腦膜炎型分離株和食品及環(huán)境分離株間差異較大,但迄今為止尚未對(duì)其功能特性進(jìn)行深入研究。本文以從暴發(fā)李斯特菌病的綿羊腦內(nèi)分離的血清型4b的Lm NTSN菌株的InlF蛋白為研究對(duì)象,以多種非吞噬細(xì)胞及小鼠和豚鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?深入研究4b型菌株InlF蛋白的致病作用,為揭示Lm致病機(jī)理提供了新認(rèn)識(shí)。1 Lm內(nèi)化素家族基因體內(nèi)外感染條件下轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性以5種非吞噬細(xì)胞(人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系Caco-2、人肝癌細(xì)胞系HepG2、人腦內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC、鼠肝細(xì)胞系BRL3A、鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3)為體外感染模型,BALB/c小鼠和豚鼠為體內(nèi)感染模型,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)LmNTSN體內(nèi)外感染后的9種內(nèi)化素基因(inlA、inlB、inlC、inlC2、inlD、inlF、inlI、inlJ、vip)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,在體外感染條件下,除HBMEC細(xì)胞外,Lm感染非吞噬細(xì)胞系后其inlF、inlI、inlJ、vip基因均顯著上調(diào)表達(dá)；在體內(nèi)口服感染條件下,內(nèi)化素基因在小鼠及豚鼠脾臟和肝臟中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平趨勢(shì)一致；大腦中內(nèi)化素基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在差異,其中inlF、inlI、vip基因僅在豚鼠腦組織中顯著性上調(diào)。以上結(jié)果提示,除小鼠腦組織外,inlF基因在Lm體內(nèi)外感染中發(fā)揮重要作用；此外,還預(yù)示4b型Lm感染小鼠和豚鼠的致病機(jī)制存在一定的差異。2 LmNTSN內(nèi)化素蛋白InlF的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)本研究對(duì)LmNTSN的inlF基因進(jìn)行了克隆,并對(duì)其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了生物學(xué)信息預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示,InlF蛋白是一個(gè)含有亮氨酸重復(fù)區(qū)域(LRRs)和LPXTG結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁表面蛋白,其N(xiāo)末端含有長(zhǎng)為35個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列,13個(gè)LRRs序列在蛋白的高級(jí)構(gòu)象上內(nèi)凹形成口袋狀,與內(nèi)化素InlA蛋白結(jié)構(gòu)相似,C末端的LPXTG結(jié)構(gòu)可被轉(zhuǎn)肽酶A (StrA)識(shí)別切割并共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞壁磷壁酸。利用MEGA5軟件對(duì)InlF氨基酸序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示LmNTSN的InlF蛋白與譜系Ⅰ中菌株的InlF蛋白高度同源,而譜系Ⅰ、Ⅱ中菌株的InlF蛋白同源性較低(78%)。利用低溫表達(dá)載體pCold成功地表達(dá)了InlF蛋白,SDS-PAGE結(jié)果顯示,40kDa的目標(biāo)蛋白以包涵體的形式存在。以弗氏佐劑聯(lián)合InlF蛋白皮下免疫BALB/c小鼠,用間接ELISA方法對(duì)InlF蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的抗InlF血清IgG效價(jià)測(cè)定結(jié)果顯示,血清效價(jià)為1：800。InlF蛋白的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)為其功能研究提供了依據(jù),該蛋白的原核表達(dá)和多抗的制備為其功能研究提供了生物材料。3 LmNTSN △inlF缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的研究利用同源重組技術(shù)成功地構(gòu)建了inlF基因的缺失突變株LmNTSN △inlF,以五種非吞噬細(xì)胞系為體外感染模型、小鼠和豚鼠為體內(nèi)感染模型,對(duì)其功能進(jìn)行了研究。RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果表明,缺失突變株中的inlF基因不能有效轉(zhuǎn)錄；提取LmNTSN △inlF的菌體蛋白進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果顯示抗InlF的多克隆抗體未檢測(cè)到大小為88kDa的靶蛋白,從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平證明inlF基因已成功從NTSN基因組中敲除。缺失突變株LmNTSN△inlF的生長(zhǎng)曲線、生理生化特性結(jié)果顯示,inlF基因缺失突變株在BHI液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)及代謝特性與野生株相比無(wú)顯著性差異。選用五種人源和鼠源的非吞噬細(xì)胞(人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系Caco-2、人肝癌細(xì)胞系HepG2、人腦內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC、鼠肝細(xì)胞系BRL3A、鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3)為體外感染模型進(jìn)行細(xì)胞黏附、侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,△inlF缺失株對(duì)細(xì)胞黏附侵襲的能力與野生株相比無(wú)顯著差異。選取小鼠小腸為體外、體內(nèi)感染模型,對(duì)InlF在早期感染中的作用進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,在體外和體內(nèi)感染小腸1h時(shí),△inlF缺失株對(duì)腸道黏附能力均顯著低于野生株(P0.05)；在體內(nèi)感染3h和5h時(shí),△inlF缺失株分別在派伊爾氏結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中定植,且其在腸系膜淋巴結(jié)中的載菌量與野生株之間存在顯著性差異(P0.05),由此表明InlF蛋白在Lm感染早期的黏附和定植過(guò)程中發(fā)揮作用。此外,以小鼠和豚鼠為體內(nèi)口服感染模型,對(duì)inlF缺失株在體內(nèi)的感染動(dòng)態(tài)、組織分布和病理變化進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示,在小鼠口服感染4h時(shí),△inlF缺失株在肝臟中的定植數(shù)量顯著低于野生株(P0.05),而脾臟、小腸、腸系膜淋巴結(jié)中的載菌量與野生株相比無(wú)明顯差異；在后期感染中,△inlF與野生株在這些內(nèi)臟中的定植數(shù)量無(wú)顯著差異�？诜腥倦嗍�6h后,△inlF缺失株在脾臟、肝臟中的定植能力顯著降低(P0.01,P0.05)；感染24h后,在脾臟、肝臟中的增殖能力均極顯著低于野生株(P0.001)。病理切片結(jié)果顯示△inlF缺失株對(duì)豚鼠的毒力明顯低于野生株。由此可知,與小鼠感染模型相比,In1F蛋白在Lm感染豚鼠后突破腸道屏障并在脾臟、肝臟中的定植和致病中發(fā)揮更加重要的作用。綜上所述,對(duì)譜系Ⅰ的4b型菌株LmNTSN的InlF蛋白功能研究結(jié)果表明,InlF蛋白對(duì)Lm突破小鼠和豚鼠腸道屏障過(guò)程中的早期黏附、侵入及在肝臟中的定植發(fā)揮重要作用；對(duì)Lm口服感染豚鼠后在肝臟和脾臟中定植的作用強(qiáng)于對(duì)小鼠的感染和致病作用,表明InlF蛋白是4b型菌株NTSN的重要毒力因子,本研究為探索InlF蛋白在Lm感染宿主中突破腸道屏障和血腦屏障的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：單核細(xì)胞增生李斯特菌 InlF蛋白 血清型4b 突變株 小鼠 豚鼠 非吞噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61;R378
【目錄】：

• 中文摘要2-5
• Abstract5-8
• 符號(hào)說(shuō)明8-11
• 綜述 單核細(xì)胞增生李斯特菌致病機(jī)制研究進(jìn)展11-23
• 一、單核細(xì)胞增生李斯特菌的內(nèi)化素家族及其作用機(jī)制11-15
• 二、單核細(xì)胞增生李斯特菌其他毒力因子及其作用機(jī)制15-16
• 三、單核細(xì)胞增生李斯特菌突破宿主三大屏障的作用機(jī)制16-18
• 四、動(dòng)物感染模型18
• 五、總結(jié)18-19
• 參考文獻(xiàn)19-23
• 第一章 體內(nèi)外感染條件下Lm內(nèi)化素基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性23-36
• 1 材料與方法23-26
• 1.1 材料23-24
• 1.2 方法24-26
• 2 結(jié)果26-32
• 2.1 熒光定量PCR檢測(cè)Lm侵襲細(xì)胞系時(shí)內(nèi)化素基因的表達(dá)差異26-29
• 2.2 LmNTSN感染小鼠時(shí)內(nèi)化素基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平29-30
• 2.3 LmNTSN感染豚鼠時(shí)內(nèi)化素基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平30-32
• 3 討論32-34
• 參考文獻(xiàn)34-36
• 第二章 LmNTSN內(nèi)化素蛋白InlF的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)36-50
• 1 材料與方法36-40
• 1.1 材料36-37
• 1.2 方法37-40
• 2 結(jié)果40-46
• 2.1 單核細(xì)胞增生李斯特菌NTSN InlF蛋白生物信息學(xué)預(yù)測(cè)40-43
• 2.2 Lm菌株InlF蛋白氨基酸序列比較結(jié)果43-45
• 2.3 InlF蛋白的原核表達(dá)和多抗制備45-46
• 3 討論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 第三章 LmNTSN△inlF缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的研究50-71
• 1 材料與方法50-55
• 1.1 材料50-51
• 1.2 方法51-55
• 2 結(jié)果55-66
• 2.1 LmNTSN inlF基因缺失株的構(gòu)建55-58
• 2.2 LmNTSN△inlF生理生化特性測(cè)定58-59
• 2.3 Lm對(duì)非吞噬細(xì)胞系的黏附侵襲實(shí)驗(yàn)59-61
• 2.4 Lm對(duì)小鼠毒力的測(cè)定61-62
• 2.5 Lm對(duì)小鼠腸道的早期感染試驗(yàn)62-63
• 2.6 Lm對(duì)BALB/c小鼠的感染63-64
• 2.7 Lm對(duì)豚鼠的感染64-65
• 2.8 豚鼠感染后組織病理切片分析65-66
• 3 討論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 全文總結(jié)71-72
• 致謝72-73
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文73-74

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 趙丹;4b型單核細(xì)胞增生李斯特菌InlF蛋白的致病機(jī)制研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：4b型單核細(xì)胞增生李斯特菌InlF蛋白的致病機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：264877