【摘要】：背景:網(wǎng)膜素1(Omentin-1)是一種新型脂肪因子,主要由內(nèi)臟脂肪組織中間質(zhì)血管細(xì)胞表達(dá)。Omentin-1也曾被稱為內(nèi)凝集素1(intelectin-1,ITLN1)、腸乳鐵蛋白受體、內(nèi)皮凝集素HL-1或呋喃半乳糖結(jié)合凝集素。研究發(fā)現(xiàn),Omentin-1參與維持機(jī)體能量平衡、葡萄糖代謝、心血管保護(hù)、抗炎、氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞功能調(diào)控等生理病理過程,與肥胖癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、腫瘤和腦梗死等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。重組Omentin-1蛋白作為Omentin-1功能驗(yàn)證及探索其在相關(guān)疾病中作用機(jī)制的重要工具受到研究者們的廣泛關(guān)注。由于血漿中存在的Omentin-1蛋白為三聚體狀態(tài),而目前商品化的Omentin-1蛋白多為原核生物表達(dá),蛋白結(jié)構(gòu)并不能滿足這一特性。為最大程度模擬血漿Omentin-1蛋白的生物活性,進(jìn)一步解析Omentin-1蛋白的生理病理功能,獲得Omentin-1三聚體蛋白具有重要意義。目的:建立Omentin-1蛋白真核表達(dá)系統(tǒng),純化真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的Omentin-1蛋白,并完成純化Omentin-1蛋白的相對分子質(zhì)量、純度及濃度的鑒定。方法:在基礎(chǔ)載體pEGFP-N1(4733bp)上構(gòu)建相對分子質(zhì)量大小相似的Flag-ITLN1(4905bp)和ITLN1-Flag(4896bp)兩種質(zhì)粒,雙酶切實(shí)驗(yàn)和DNA測序完成質(zhì)粒鑒定。以pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞后的熒光強(qiáng)度優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。Flag-ITLN1(4905bp)和ITLN1-Flag(4896bp)以優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染條件轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞,并設(shè)置pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染孔評估轉(zhuǎn)染效率,建立Omentin-1真核表達(dá)系統(tǒng)。定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantative reverse transcription-PCR,qRT-PCR)檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后(24h)HEK 293細(xì)胞Omentin-1基因表達(dá)量差異,蛋白質(zhì)印跡法(western blotting,WB)檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后(48h)HEK 293細(xì)胞培養(yǎng)液中Omentin-1蛋白表達(dá)量差異,篩選出Omentin-1蛋白表達(dá)量相對較高的Omentin-1蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)。收集所建立的Omentin-1蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)液,采用二苯基砜樹脂耦連法完成對細(xì)胞培養(yǎng)液中Omentin-1蛋白的純化,分別運(yùn)用截留分子量為30kDa、100kDa的超濾管分離混雜蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳對純化的Omentin-1蛋白進(jìn)行相對分子質(zhì)量和純度鑒定,WB及質(zhì)譜對純化的Omentin-1蛋白進(jìn)行定性鑒定,BCA法測定純化的Omentin-1蛋白濃度。結(jié)果:1.Flag-ITLN1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞后細(xì)胞Omentin-1基因、培養(yǎng)液中Omentin-1蛋白表達(dá)量均高于ITLN1-Flag質(zhì)粒。2.成功建立Flag-ITLN1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞為基礎(chǔ)的Omentin-1蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)。3.成功運(yùn)用二苯基砜樹脂耦連法完成對Omentin-1蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的Omentin-1蛋白的純化。4.純化后的Omentin-1蛋白相對分子質(zhì)量約為130kDa,純度90%,濃度為0.035mg/mL。結(jié)論:1.以Flag-ITLN1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞為基礎(chǔ)的Omentin-1真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組Omentin-1蛋白。2.Omentin-1真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組Omentin-1蛋白為Omentin-1三聚體蛋白。
【學(xué)位授予單位】：延安大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R341

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本文編號：2636130