【摘要】：疫苗作為一種預(yù)防性或治療性的生物制品,越來越受到人們重視。在分類上,疫苗可分為傳統(tǒng)的滅活疫苗、減毒活疫苗和新型的基因工程疫苗。本文所研究的病毒樣顆粒疫苗VLPs即為一種基因工程疫苗,因該疫苗不含有病毒核酸,但可以刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng),具有很高的安全性和較強(qiáng)的免疫原性。本論文成功構(gòu)建并獲得了表達(dá)兩種烈性傳染病病毒基孔肯雅病毒和尼帕病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重組桿狀病毒,用重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞,經(jīng)過一系列純化:濃縮、超離、脫糖等步驟獲得了基孔肯雅病毒和尼帕病毒的病毒樣顆粒VLPs。該研究工作為兩種病毒VLPs疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本論文共分為四章:第1章:前言。本章主要介紹了病毒樣顆粒疫苗的發(fā)展歷程及各種表達(dá)系統(tǒng),包括原核的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、真核的酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、應(yīng)用廣泛的昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、具有良好翻譯后修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和植物生物反應(yīng)器系統(tǒng)。病毒樣顆粒VLPs疫苗作為一種新型疫苗,有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì),也有很多不足之處,在本章,我們具體介紹了每種表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),并對(duì)基孔肯雅病毒CHIKV和尼帕病毒NiV疫苗的研發(fā)進(jìn)展做了總結(jié)。第2章:基孔肯雅病毒CHIKV VLPs的構(gòu)建。利用當(dāng)前應(yīng)用廣泛且便于大規(guī)模生產(chǎn)的昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建出并經(jīng)過一系列鑒定獲得了正確的含有基孔肯雅病毒完整結(jié)構(gòu)蛋白的重組桿狀病毒,并將重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞系,通過一系列實(shí)驗(yàn),包括SDS-PAGE、Western blotting、免疫熒光IFA和透射電鏡等方法確定了基孔肯雅病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)和病毒樣顆粒的形成。顆粒形態(tài)和大小與野生型基孔肯雅病毒相似。通過將重組桿狀病毒感染Sf9懸浮細(xì)胞,利用蔗糖密度梯度離心成功純化出基孔肯雅病毒的病毒樣顆粒VLPs。第3章:基孔肯雅病毒CHIKV VLPs免疫原性研究。免疫小鼠,通過分離小鼠血清和小鼠脾細(xì)胞,分別檢測(cè)免疫前后小鼠體內(nèi)特異性抗體的變化以及細(xì)胞因子的含量,以檢測(cè)病毒樣顆粒的免疫原性。第4章:尼帕病毒NiV VLPs的構(gòu)建。通過利用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),成功構(gòu)建并獲得了含有尼帕病毒基質(zhì)蛋白M、融合蛋白F和糖蛋白G的兩種重組桿狀病毒。與前面研究基孔肯雅病毒相似,我們同樣通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá),確定VLPs的形成;通過大量表達(dá)VLPs,負(fù)染后電鏡觀察,可以觀察到尼帕病毒的病毒樣顆粒。第5章:展望。本章主要分析病毒樣顆粒疫苗的研究進(jìn)展及未來發(fā)展方向。
【圖文】：

基孔肯雅病毒 CHIKV 和尼帕病毒 NiV 病毒樣顆粒的構(gòu)建和免疫原性研究注意：純化的病毒樣品進(jìn)行免疫電鏡觀察時(shí)濃度不宜過高，必要時(shí)需進(jìn)理后才能進(jìn)行吸附。濃度過高或不經(jīng)脫糖處理可能導(dǎo)致鎳網(wǎng)膜破碎影響和電鏡觀察�？贵w稀釋度需根據(jù)抗體純度和效價(jià)進(jìn)行調(diào)整。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果.1 抗體的制備為了制備檢測(cè)用抗體，我們成功構(gòu)建了含有基孔肯雅病毒 CHIKV 結(jié)構(gòu)粒，并經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了抗原蛋白。其中，，由于 C 片段全長未表達(dá) C 片段截短為兩部分，C1 大小為 471 b（p8-164 aa），C2 大小為 615 bp（57。結(jié)果如圖 1.1-1.4 所示：

結(jié)果如圖 1.1-1.4 所示：圖 1.1 原核表達(dá) pET28a-CHIKV E1 的 SDS-PAGE 和 Western blot 檢測(cè)結(jié)果Figure 1.1 SDS-PAGE and Western blot results of prokaryotic expression ofpET28a-CHIKV E1M:Maker; NC: Negative control; In: Whole bacterial solution; Su:Supernatant; IB:Inclusion body. The protein size is 53 kDa, mainly in the form of inclusion bodies. Theprimary antibody is an antibody against LT-tag in a ratio of 1:5000.
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢病毒研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392-33

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