【摘要】：目的:衣原體是一類專性胞內(nèi)寄生菌,可以引起多種人類疾病,例如沙眼、生殖道感染、肺炎等。已知衣原體感染誘發(fā)機(jī)體多種細(xì)胞反應(yīng),但至今仍無有效的疫苗可以預(yù)防衣原體感染。恒定自然殺傷T細(xì)胞(iNKT)細(xì)胞是NKT細(xì)胞的重要組成部分,可通過分泌IFN-γ等細(xì)胞因子調(diào)控免疫細(xì)胞及免疫應(yīng)答。本研究旨在探討衣原體呼吸道感染中iNKT細(xì)胞對重要的免疫細(xì)胞——肺巨噬細(xì)胞的數(shù)量、亞群的動態(tài)變化、極化以及功能的影響及其機(jī)制,明確衣原體感染中iNKT細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。雖然衣原體感染可以引起多種疾病,但有研究證實(shí)一些感染可以抑制過敏/哮喘反應(yīng)。之前我們的研究發(fā)現(xiàn)衣原體活化的樹突狀細(xì)胞(DC)及自然殺傷(NK)細(xì)胞可以抑制卵蛋白(OVA)或豚鼠草誘發(fā)的小鼠實(shí)驗(yàn)性過敏反應(yīng)。由于B細(xì)胞是宿主重要的抗體分泌細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞,還可以通過分泌細(xì)胞因子參與及調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答,因此本研究擬探討衣原體感染誘導(dǎo)活化的B細(xì)胞是否對OVA致敏/激發(fā)的小鼠氣道過敏反應(yīng)發(fā)揮影響及其影響機(jī)制。方法:使用一定劑量的Cm呼吸道感染Jα18~(-/-)(iNKT KO)小鼠和對照的野生型(WT)小鼠。在感染的第0、3、7、14天制備小鼠脾和肺單個(gè)細(xì)胞,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測肺巨噬細(xì)胞數(shù)量、亞群的動態(tài)變化和極化,研究Cm呼吸道感染中iNKT細(xì)胞對巨噬細(xì)胞及亞群的影響;利用磁珠分選和流式細(xì)胞術(shù)分離和純化小鼠肺巨噬細(xì)胞進(jìn)行過繼轉(zhuǎn)移,探討iNKT細(xì)胞對巨噬細(xì)胞抗衣原體感染功能的影響;利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測肺巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子水平,探討iNKT細(xì)胞影響巨噬細(xì)胞功能的機(jī)制;利用脾來源的iNKT細(xì)胞和骨髓來源的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)探討iNKT細(xì)胞對巨噬細(xì)胞抗衣原體感染的作用及機(jī)制。使用一定劑量的鼠型衣原體(Cm)呼吸道感染小鼠,分離感染不同時(shí)間點(diǎn)脾和肺單個(gè)細(xì)胞,利用流式細(xì)胞術(shù)及胞內(nèi)因子染色檢測B細(xì)胞表面分子和細(xì)胞因子分泌,明確衣原體感染對B細(xì)胞的影響。磁珠分選純化未感染小鼠脾B(na?ve B)細(xì)胞和Cm感染第10天小鼠脾B(Cm-B)細(xì)胞,通過尾靜脈輸注或鼻吸的方式轉(zhuǎn)移給OVA誘發(fā)的過敏小鼠體內(nèi),對小鼠肺組織切片進(jìn)行HE染色和PAS染色用以評判過敏小鼠肺組織炎性浸潤和氣道黏液分泌;胞內(nèi)染色和ELISA法檢測小鼠Th2應(yīng)答;ELISA法檢測血清免疫球蛋白水平。利用抗體封閉Cm-B IFN-γ的產(chǎn)生探究Cm-B抑制過敏反應(yīng)的機(jī)制。結(jié)果:衣原體感染誘發(fā)WT和iNKT KO小鼠肺組織巨噬細(xì)胞數(shù)量及其單核及未分化巨噬細(xì)胞(Mo/Mφ)亞群和間質(zhì)巨噬細(xì)胞(IMs亞群)增多,對肺泡巨噬細(xì)胞(AM)亞群無明顯影響。iNKT細(xì)胞的缺失降低衣原體誘導(dǎo)的各亞群的增殖和M1型極化水平以及減少M(fèi)o/Mφ和IMs亞群分泌TNF-α。與過繼轉(zhuǎn)移WT小鼠肺巨噬細(xì)胞比較,過繼轉(zhuǎn)移iNKT KO肺巨噬細(xì)胞降低Cm感染小鼠抗衣原體感染免疫保護(hù)。iNKT細(xì)胞缺失降低Cm感染激發(fā)的肺巨噬細(xì)胞內(nèi)JAK/STAT信號通路活化水平。衣原體感染誘導(dǎo)小鼠肺、脾B細(xì)胞數(shù)量增多、MHC II及CD86分子高表達(dá)、IFN-γ分泌增多。與na?ve B細(xì)胞相比較,Cm-B細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移可以抑制受體小鼠OVA誘導(dǎo)的過敏反應(yīng),表現(xiàn)為小鼠肺組織病理損傷減輕,氣道分泌物和肺組織炎性滲出減少,肺、脾細(xì)胞IL-4、IL-5產(chǎn)生降低以及血清OVA特異性及總IgE和IgG1水平降低。進(jìn)一步使用抗體封閉Cm-B細(xì)胞分泌的IFN-γ可以消除Cm-B對OVA誘導(dǎo)的過敏反應(yīng)的抑制作用。結(jié)論:衣原體呼吸道感染中,iNKT細(xì)胞通過分泌IFN-γ作用于JAK/STAT信號通路影響巨噬細(xì)胞極化,進(jìn)而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗衣原體感染的能力。衣原體呼吸道感染可以增加B細(xì)胞數(shù)量、促進(jìn)B細(xì)胞活化、增強(qiáng)B細(xì)胞的功能,Cm-B細(xì)胞通過分泌IFN-γ對OVA誘導(dǎo)的氣道過敏反應(yīng)發(fā)揮抑制作用。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文抗病原菌感染，被認(rèn)為是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的“橋梁”[18]。NKT 細(xì)到刺激后可增強(qiáng)固有免疫樣細(xì)胞、DC 和 B 細(xì)胞的募集和成熟[20, 21]。根據(jù) T的不同，NKT 細(xì)胞被分為兩群。I 型 NKT 細(xì)胞，即 iNKT（invariant NKT）被認(rèn)為是經(jīng)典的 NKT 細(xì)胞，小鼠 iNKT 細(xì)胞受體恒定部分 TCRV 鏈由 V J 18 組成，與 Vβ8、Vβ7 或 Vβ2 組合；人 iNKT 細(xì)胞受體恒定部分 TC則由 V 24 和 J 18 組成[17]。II 型 NKT 細(xì)胞則表達(dá)多種 TCR 、β 鏈組合類。由于 NKT 細(xì)胞兩種亞型細(xì)胞 TCR 組成的不同，J 18 缺陷小鼠可用于 iN研究；而 CD1d 缺陷小鼠則是 NKT 細(xì)胞缺乏小鼠，可運(yùn)用兩種小鼠對比研型 NKT 細(xì)胞[23-25]。iNKT 細(xì)胞還能通過胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和轉(zhuǎn)錄因子的后類進(jìn)行亞群的區(qū)分（圖 1）：iNKT1 表達(dá) T-bet，主要產(chǎn)生 IFN-γ[26]；iN達(dá) GATA 結(jié)合蛋白 3（Gata-3），，主要分泌 IL-4[26, 27]；iNKT17 表達(dá) RoR要分泌 IL-17[26-29]。

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文免疫反應(yīng)以及其他的獨(dú)立炎癥，包括氣道高反應(yīng)性、氣道重塑、咳嗽反射高反應(yīng)性和反復(fù)感染等。作為一種異質(zhì)性過敏反應(yīng)，哮喘在臨床上存在多種類型，其中以 Th2 介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)最為常見（圖 2），多見于 80%的未接受皮質(zhì)類固醇治療患者和 50%的接受皮質(zhì)類固醇治療患者中[46, 47]，而這個(gè)比例還可能因?yàn)榛颊呓邮苤委熀蟀Y狀被抑制而有所低估[48]，因此對于該哮喘類型的研究刻不容緩。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2589969