【摘要】：金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)是一種重要的人類和動物病原體細菌,能夠引起多種類型的感染性疾病,在臨床上主要通過使用抗生素來進行治療。然而隨著耐藥性菌株,特別是甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(MRS A)的全球性傳播,抗生素治療遇到了前所未有的挑戰(zhàn)。由于獲得了能夠編碼PBP2a這種替代性青霉素結(jié)合蛋白的基因mecA, MRSA菌株對幾乎所有類型的p內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生了抗性�；騧ecA位于一個可移動的遺傳元件SCCmec上,該元件上同時也攜帶有編碼一套整合酶的基因ccrAB或ccrC,它們編碼的Ccr整合酶參與了SCCmec的剪切和整合,而且ccrAB或ccrC的表達水平緊密關(guān)聯(lián)著SCCmec元件的穩(wěn)定性及其平行基因轉(zhuǎn)移。早期的研究發(fā)現(xiàn)ccrAB基因只在一小部分的細胞中有表達,而且其所占的比例或者ccrAB基因整體的表達水平可以明顯受到溫度和抗生素等外界因素的影響,說明在ccrAB基因的表達過程中存在著一套非常精細的調(diào)控過程,而關(guān)于這一調(diào)控機理的研究還是一片空白。本課題主要通過以下兩部分的研究對ccrAB表達的調(diào)控機制進行闡述,1.輔助性sigma因子在ccrAB轉(zhuǎn)錄以及SCCmec剪切過程中的調(diào)控輔助性sigma因子在金葡菌中介導(dǎo)了多種環(huán)境因子的感應(yīng)以及細菌細胞生理過程的調(diào)控,早期的研究也發(fā)現(xiàn)SigH參與了金葡菌中原噬菌體基因組剪切和整合的調(diào)控。這些研究結(jié)果提示我們輔助性sigma因子也有可能參與調(diào)控了SCCmec元件的剪切和整合。在該研究中,我們首先確定了ccrA和ccrB處于同一個操縱子中,而且它們的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出了明顯的時相依賴性。我們分別在N315菌株中過表達了SigB, SigH, SigS三種輔助性sigma因子,結(jié)果顯示SigB的過表達明顯提高了ccrA基因的轉(zhuǎn)錄水平,進一步的研究也發(fā)現(xiàn)SigB的過表達能夠明顯提高SCCmec元件的剪切。通過引物延伸實驗和5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)我們鑒定出了一個之前從未被報道的SigB識別序列,而且該序列存在于多種SCCmec Ⅱ型和Ⅳ型的菌株中。2.反向重復(fù)序列以及蛋白調(diào)控因子SarS在ccrAB轉(zhuǎn)錄以及SCCmec剪切過程中的調(diào)控在對N315菌株中ccrAB基因啟動子區(qū)域的序列分析過程中,我們發(fā)現(xiàn)了一段反向重復(fù)序列,進一步分析發(fā)現(xiàn)它廣泛存在于不同類型的攜帶ccrAB基因的SCCmec元件中,而且在堿基組成和相對于ccrA翻譯起始位點的位置上都非常保守。堿基替換相關(guān)的配對堿基可以明顯提高ccrAB基因啟動子的活性,而且無論是替換反向重復(fù)序列的上游配對部分還是下游配對部分對ccrAB基因啟動子活性的影響基本一致,說明該段序列是通過一種特殊的空間結(jié)構(gòu)來影響ccrAB的表達,此外,通過在N315基因組中直接替換該配對堿基或者通過在ccrAB過表達質(zhì)粒中替換該部分堿基可以明顯影響SCCmec元件的穩(wěn)定性。以上結(jié)果說明反向重復(fù)序列在ccrAB基因的表達以及SCCmec元件的穩(wěn)定性方面起到了無可忽視的作用。通過DN A pull-down的方法我們發(fā)現(xiàn)了一個可以特異性結(jié)合ccrAB啟動子的調(diào)控蛋白SarS, EMSA的結(jié)果顯示它可以特異性的同上述反向復(fù)復(fù)序列結(jié)合。實時定量PCR以及啟動子同lacZ基因融合報告的結(jié)果顯示SarS在細菌生長的穩(wěn)定期對ccrAB基因的表達進行了調(diào)控,而且過表達SarS可以明顯提高ccrAB基因的轉(zhuǎn)錄和增強SCCmec元件的剪切。
【圖文】：

在Ａ類ｗｅｅ基因簇中，相關(guān)的基因包括由／ｎｅｃ４基因組成的某一方向的操逡逑縱子＾＾及與其方向相反的ｍｅｃｉ？／－／ｎｅｃ／－ｍｅｃｉ？２調(diào)控基因組成的操縱子，其中，，；ｎｅｃ／４逡逑基因的轉(zhuǎn)錄受／ｎｅｃ／ｆ／－ｆｆｉｅｃ／－ｍｅｃ／口邋Ｈ元信號系統(tǒng)的調(diào)控（圖１．６）（Ａｒｅｄｅｅｔａｌ．邋２０１２）。逡逑簡單來說，Ｐ內(nèi)筋胺類抗生素通過巧活ＭｅｃＲｌ誘導(dǎo)ｍｅｃ／１和；ｎｅｃＷ－ｍｅｃ／－ｆｆ？ｅｃ化２逡逑基因的轉(zhuǎn)錄。在該過程中，ＭｅｃＲ２蛋白解除ＭｅｃＩ二聚體的穩(wěn)定性，干擾ＭｅｃＩ逡逑二聚體對ｍｅｃ＾啟動子序列的結(jié)合，同時促進它們的蛋白水解失活，最終導(dǎo)致逡逑基因轉(zhuǎn)錄的持續(xù)性誘導(dǎo)。當ＰQg憸胺類抗生素被耗盡時，ＭｅｃＲｌ蛋白不再逡逑被巧活，穩(wěn)定狀態(tài)的ＭｅｃＩ二巧體蛋白結(jié)合到基因的啟動子上，多余的逡逑ＭｅｃＲｌ蛋白則錯定在細胞膜上，而Rp余的ＭｅｃＲ２蛋白則最有可能通過胞內(nèi)蛋白逡逑降解途徑被降解。逡逑該巧控過程非常類似于ＷａＺ基因同其調(diào)控基因６虹Ｗ－Ｗｏ／的表達調(diào)控過程。逡逑值得一提的是，在許多苗株中這兩查巧巧系統(tǒng)是同時存在的，此時，施ｉＺ和逡逑同椅被這兩種不同的調(diào)控系統(tǒng)所巧控：Ｂｌａｌ與ＭｅｃＩ巧可ＩＪＪＩＷ二巧體的形式結(jié)合逡逑１０逡逑

盡管Q喦盎共磺宄嗆沃直局實耐槐淶賈鋁隋澹鄭桑櫻輛甑某魷鄭髦盅星苫瑰義鮮欠⑾至隋澹鄭桑櫻羻-株所具有的一些共同特征，這巧特征包括變厚的細胞壁和較低逡逑交聯(lián)度的膚聚糖鏈。如圖１．８所示，在ＶＩＳＡ菌株的細胞壁上存在著大量的自由逡逑１２逡逑
【學位授予單位】：中國科學技術(shù)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378.11

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本文編號：2587496