【摘要】：研究背景結(jié)核病(tuberculosis)是一種嚴(yán)重危害全球的重大傳染性疾病,主要由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis)感染引起。結(jié)核病的病死率在傳染性疾病中居于第二位,僅次于人免疫缺陷病毒感染(human immunodeficiency virus,HIV)的致死率。我國(guó)是結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一,其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期據(jù)我國(guó)甲、乙類傳染病前列,占全球總結(jié)核病病例數(shù)的11%。結(jié)核病難于控制的主要原因是缺乏有效的結(jié)核病疫苗。另外,結(jié)核分枝桿菌可以在人體巨噬細(xì)胞內(nèi)以潛伏狀態(tài)存在,借此逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)和藥物對(duì)其的殺傷作用�？ń槊�(Bacille Calmette-Guerin,BCG)是目前臨床應(yīng)用廣泛的預(yù)防結(jié)核病的疫苗,但是接種BCG預(yù)防結(jié)核病的保護(hù)效應(yīng)不確定。BCG接種可以預(yù)防兒童患嚴(yán)重的粟粒性結(jié)核及腦膜炎結(jié)核,但是BCG的保護(hù)性免疫反應(yīng)隨著年齡的增加逐漸減弱,對(duì)成人肺結(jié)核缺乏有效的免疫保護(hù)。目前,處于研究階段的新型結(jié)核分枝桿菌疫苗包括活菌疫苗和亞單位疫苗。人們普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為,亞單位疫苗可以用于加強(qiáng)BCG免疫所引起的免疫應(yīng)答,進(jìn)而延長(zhǎng)并維持BCG的保護(hù)效果。我們前期共構(gòu)建并評(píng)價(jià)了 6個(gè)融合蛋白亞單位疫苗ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4(EAMM),Mtb10.4-HspX(MH),ESAT6-Mtb8.4,Mtb10.4-Ag85B,ESAT6-Ag85B和ESAT6-RpfE,發(fā)現(xiàn)EAMM保護(hù)效果最好。此外,EAMM(僅由結(jié)核分枝桿菌復(fù)制期抗原組成)和MH(由結(jié)核分枝桿菌復(fù)制期和潛伏期抗原組成)聯(lián)合應(yīng)用時(shí),其保護(hù)效果比單獨(dú)應(yīng)用時(shí)更好。研究目的為了建立對(duì)不同生長(zhǎng)狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的免疫力,本研究選擇具有免疫優(yōu)勢(shì)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)制期抗原和休眠期抗原,構(gòu)建融合了結(jié)核分枝桿菌多階段抗原的亞單位疫苗。此外,探索抗原劑量和免疫調(diào)節(jié)劑雷帕霉素對(duì)亞單位疫苗所誘導(dǎo)的免疫記憶的作用,以研究影響亞單位疫苗長(zhǎng)期保護(hù)效率的因素。研究方法在本研究中,我們結(jié)合結(jié)核分枝桿菌復(fù)制期抗原ESAT6,Ag85B,MPT64,Mtb8.4 和潛伏期抗原 HspX,構(gòu)建融合蛋白 ESAT6-Ag85B-MPT64(190-198)-Mtb8.4-HspX(EAMMH),因分子量為69kD,簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)T69。融合蛋白構(gòu)建成功之后,我們用大腸埃希菌BL21對(duì)其進(jìn)行表達(dá),并利用鹽析和層析技術(shù)相結(jié)合的方法將其分離純化。融合蛋白LT69和佐劑陽離子脂質(zhì)體二甲基三十六烷基錢(dimo-thylidioctyl ammonium bromide,DDA)和聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidyli cacid,PolyI:C)混合,構(gòu)建結(jié)核亞單位疫苗。然后,我們將LT69疫苗免疫小鼠,檢測(cè)該疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的抗原特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答;疫苗末次免疫30周后,將疫苗免疫的小鼠用結(jié)核分枝桿菌H37Rv株經(jīng)呼吸道感染,評(píng)價(jià)該疫苗在小鼠體內(nèi)抗結(jié)核的保護(hù)效果。此外,將不同劑量(50μg、10 μg和2μg)的LT69疫苗免疫小鼠,檢測(cè)不同劑量的疫苗所誘導(dǎo)的免疫記憶的差異,并評(píng)價(jià)不同劑量疫苗免疫所產(chǎn)生的長(zhǎng)期保護(hù)效果。同時(shí),我們將LT69疫苗和雷帕霉素聯(lián)合免疫小鼠,評(píng)價(jià)雷帕霉素對(duì)LT69疫苗所誘導(dǎo)的記憶性T細(xì)胞的影響,及其對(duì)疫苗長(zhǎng)期保護(hù)效果的影響。研究結(jié)果成功構(gòu)建了融合蛋白LT69。LT69在大腸埃希菌BL21中高效表達(dá),應(yīng)用硫酸銨鹽析和層析相結(jié)合的方法成功將其分離純化。LT69疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗原特異性IFN-,γ、IL-2和抗體IgG1、IgG2c。結(jié)核分枝桿菌H37Rv(50-100 CFU)經(jīng)呼吸道氣霧攻擊小鼠后,LT69疫苗(10μg)免疫組小鼠肺臟的結(jié)核菌載量(5.85±0.39 Log10 CFU)和BCG免疫組(6.01 ±0.33 Log10 CFU)相當(dāng),低劑量LT69免疫組小鼠肺臟的結(jié)核菌載量(5.38±0.35 Log10 CFU)低于BCG組�？乖瓌┝垦芯勘砻�,低劑量LT69(2μg)疫苗接種小鼠產(chǎn)生的IFN-y的分泌水平在疫苗末次免疫6周和高劑量組沒有明顯差異,但在疫苗末次免疫24周要明顯高于高劑量(10μg和50μg)組,說明低劑量疫苗誘導(dǎo)了較長(zhǎng)期的細(xì)胞免疫記憶。在疫苗末次免疫30周后進(jìn)行的攻毒試驗(yàn)表明,低劑量LT69免疫組小鼠肺臟的結(jié)核菌載量低于高劑量組和BCG組,和免疫檢測(cè)結(jié)果一致。雷帕霉素和疫苗LT69聯(lián)合免疫,24周后進(jìn)行體外脾臟淋巴細(xì)胞功能檢測(cè)。特異性抗原刺激后,雷帕霉素聯(lián)合免疫小鼠脾細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-γ分泌水平明顯高于疫苗單獨(dú)免疫組。經(jīng)尾靜脈用5 106CFU的BCG攻擊小鼠,雷帕霉素聯(lián)合免疫小鼠體內(nèi)的細(xì)菌載量低于疫苗單獨(dú)免疫組0.8-log10 CFU。結(jié)論結(jié)核分枝桿菌亞單位疫苗LT69同時(shí)融合了結(jié)核分枝桿菌復(fù)制期抗原和休眠期抗原,免疫機(jī)體后可以清除不同代謝狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌。LT69在小鼠體內(nèi)具有較強(qiáng)的免疫原性,其保護(hù)效果達(dá)到和BCG相當(dāng)?shù)乃�。低劑量的疫苗比高劑量的疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生更長(zhǎng)久的免疫記憶,長(zhǎng)期保護(hù)效果也更強(qiáng)。雷帕霉素處理可以促進(jìn)LT69疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生更多長(zhǎng)期記憶性T細(xì)胞,從而提高疫苗的長(zhǎng)期保護(hù)效果。研究背景持留菌(persister)是在效果非常強(qiáng)的抗生素(lethal antibiotics)或者壓力(stresses)的作用下能夠繼續(xù)存活的一小群靜止期的細(xì)菌,這群細(xì)菌在適當(dāng)?shù)臈l件下可以繼續(xù)增殖。持留菌的存在造成感染患者體內(nèi)細(xì)菌的潛伏和治療后的反復(fù)發(fā)作,使細(xì)菌感染性疾病的治愈面臨挑戰(zhàn)。目前所使用的抗生素中,除了治療結(jié)核病的藥物吡嗪酰胺(PZA)具有一定的抗持留菌的作用外,其他大部分的藥物只針對(duì)復(fù)制期代謝比較活躍的細(xì)菌起作用。探索針對(duì)持留菌有效的藥物,是治療細(xì)菌感染性疾病的有效措施和手段。目前所使用的抗生素對(duì)持留菌沒有治療效果的主要原因是,在篩選抗菌的藥物時(shí)人們通常使用的是代謝活躍的復(fù)制期的細(xì)菌,而沒有考慮用持留菌模型進(jìn)行藥物篩選。研究目的本研究試圖建立包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusawrews,S.awreius)、大腸埃希菌(Escherichia co/i,E.coli)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,M/wberculosis)在內(nèi)的持留菌體外模型,從一些臨床應(yīng)用的化合物中篩選抗細(xì)菌持留菌的有效藥物,為臨床細(xì)菌持續(xù)感染性疾病的治療提供一些新的指導(dǎo)。研究方法在持留菌的研究領(lǐng)域,人們常用抗生素處理穩(wěn)定期細(xì)菌6-8小時(shí)來建立持留菌模型。在本研究中,我們用抗生素ofloxacin或者酸性和饑餓的壓力條件處理細(xì)菌,在抗生素或者壓力條件下生存下來的細(xì)菌即為持留菌。我們建立了金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和結(jié)核分枝桿菌持留菌模型,然后從FDA批準(zhǔn)的化合物庫中篩選針對(duì)這些持留菌的藥物。最后,將篩選出來的有一定效果的藥物在體外進(jìn)行效果驗(yàn)證,并進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行藥物效果的評(píng)價(jià)。研究結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)tosufloxacin對(duì)金黃色葡萄球菌持留菌具有很好的殺菌作用;tosufloxacin和colistin對(duì)大腸埃希菌持留菌具有很好的作用效果;蓖麻油酸鉀(potassium ricinoleate)、喹哪啶(quinaldine)、四環(huán)素(tetracycline)、硝苯地平(nifedipin)、蘇合香脂(storax)和阿西美辛(acemetacin)在和PZA聯(lián)合應(yīng)用時(shí),可以明顯提高PZA對(duì)結(jié)核分枝桿菌持留菌的殺菌作用。結(jié)論在本研究中我們成功建立了持留菌體外模型,并初步篩選到一些用于治療持留菌的藥物。所篩選的藥物有望用于臨床細(xì)菌感染性疾病的治療,從而提高該類疾病的治療效果、縮短治療療程和避免疾病的復(fù)發(fā)。
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圖２．２邋１邋％瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果逡逑X棽錚停停齲誨澹ǎ攏╁澹穡牛裕常埃幔ǎ┲柿＃唬ǎ茫┝硬鎰�。辶x希疲椋紓酰椋邋澹玻插澹裕瑁邋澹潁澹螅酰歟簦簀澹錚駑澹保ュ澹幔紓幔潁錚螅邋澹澹歟澹悖簦潁錚穡瑁錚潁澹螅椋簀義希歟椋媯椋悖幔簦椋錚鑠澹穡潁錚洌酰悖翦澹停停齲誨澹ǎ攏╁澹穡牛裕常埃幔ǎ╁澹穡歟幔螅恚椋洌誨澹ǎ茫╁澹裕瑁邋澹觶澹齲櫻徨澹猓澹校妹皴澹幔恚穡歟椋媯椋悖幔簦椋錚睿義，

本文編號(hào)：2565140