【摘要】：炎癥(inflammation)是具有血管系統(tǒng)的機體對損傷因子所發(fā)生的一系列復雜的防御反應,具有殺滅病原體、限制感染及修復損傷等作用,是損傷、抗損傷和修復三為一體的統(tǒng)一過程。炎癥是伴隨多種疾病狀態(tài)下一種共有的復雜的病理現(xiàn)象,體表的外傷感染和各器官的大部分常見病和多發(fā)病(如肺炎、肝炎、腎炎等)都屬于炎癥性疾病。炎癥的發(fā)生、發(fā)展和轉歸取決于體內各種促炎因素及抗炎因素在不同的環(huán)節(jié)、時相和過程相互作用和博弈時形成的復雜而又精細的調控網(wǎng)絡是否平衡。微小RNA(micro RNA,mi RNA)已被證實在炎癥反應中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。和其他分子類似,miRNA也有抑炎和促炎之分。其中的miR-214,目前研究提示主要發(fā)揮促炎作用,其機制為延緩單核細胞的凋亡及維持T細胞的活化,但miR-214能否通過直接抑制某些抑炎基因的表達來實現(xiàn)促炎尚無文獻報道。近年的研究表明,腺苷A2A受體(A2AR)活化后在外周組織通過抑制促炎細胞因子的產生和釋放、中性粒細胞浸潤等在多種器官組織損傷和炎癥模型(如缺血性肝損傷、急性肺損傷、缺血再灌注損傷及急性腎損傷模型)中發(fā)揮顯著的抑制炎癥保護作用,但A2AR的蛋白表達水平卻在上述模型中表達下調,這無疑制約了A2AR激動劑的應用。目前對A2AR自身表達調控對其抑炎作用的影響尚不清楚。鑒于mi R-214和A2AR在炎癥中均具有重要作用,那么A2AR的表達是否受到mi R-214的調控?mi RNA的加工和合成同樣受到其他分子的調控,A2AR的抑炎效應是否包括抑制miR-214的表達?以上目前均未有相關報道。為了明確mi R-214與A2AR之間在炎癥中相互表達調控的作用機制及在炎癥中的作用:在本課題中,我們首先使用生物信息學預測,篩選出mi R-214為研究對象,在小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞中,借助miR-214 mimic觀察對A2AR蛋白和mRNA表達的影響,然后利用報告基因分析解析A2AR基因3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)與mi R-214的結合位點。然后,我們猜測A2AR反過來也可能調控mi R-214的表達,使用A2AR的激動劑CGS21680和拮抗劑ZM241385、PKA抑制劑H89和NF-κB抑制劑BAY 11-7082處理小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDMs)和RAW264.7細胞,觀察對mi R-214表達的影響,探討了可能涉及的主要信號通路。最后,在bmdms中過表達mir-214檢測對炎癥因子tnf-α和il-6表達的影響,借助脂多糖(lps)誘導的小鼠急性肺損傷(ali)模型,觀察a2ar蛋白和mir-214的表達相關性以及聯(lián)合應用a2ar激動劑和mir-214抑制劑對小鼠ali模型傷情的影響。主要取得了以下研究結果:1.利用targetscan、miranda和mirmap生物信息學在線軟件預測可能調控a2ar的mirna,發(fā)現(xiàn)在3'-utr有mir-214潛在的結合位點;在raw264.7細胞中,借助mir-214mimic過表達mir-214,westernblot和real-timepcr證實,mir-214可以在蛋白水平而不是mrna水平抑制a2ar的表達;構建含a2ar3'-utr的報告基因載體,使用雙熒光素酶報告基因檢測結合定點突變,詳細解析了a2ar3'-utr與mir-214結合的精確位點;進行功能回復實驗,向轉染了mimic的細胞中同時轉染不含3'-utr的a2ar真核表達質粒,進一步確定mir-214是通過與a2ar3'-utr的特異性結合來調控其表達。以上結果提示a2ar是mir-214的另一靶基因。2.生物信息學預測在mir-214啟動子區(qū)-1000~+200存在兩個轉錄因子nf-κb可能的結合位點;據(jù)此構建了包含不同長度的mir-214啟動子區(qū)luc報告基因載體并結合定點突變,luc報告基因檢測顯示nf-κb的激活能夠促進mir-214啟動子的轉錄活性;結合染色質免疫沉淀(chip)實驗證實nf-κb的p65亞基特異性的與mir-214啟動子區(qū)-490~-481和-27~-16結合。在raw264.7細胞中,借助a2ar激動劑和拮抗劑,pka和nf-κb抑制劑,經(jīng)westernblot檢測,a2ar活化后通過pka途徑抑制iκbα的磷酸化進而抑制nf-κbp65亞基的核轉位從而抑制nf-κb通路;在bmdms和raw264.7中證實激活a2ar后通過pka-nf-κb途徑下調mir-214表達,經(jīng)emsa和chip-qpcr證實可能的機制是a2ar的活化使nf-κbp65的核轉位受到抑制,減弱其與mir-214啟動子區(qū)的結合從而降低了轉錄活性。以上結果闡明了a2ar下調mir-214表達的分子機制,綜合1中結果,初步提示在細胞炎癥模型中存在mir-214/a2ar負反饋調控環(huán)路。3.通過在bmdms中轉染mir-214agomir和lps處理,構建了mir-214過表達的細胞炎癥模型,借助real-timepcr和elisa方法檢測mir-214過表達促進了tnf-α和il-6的表達;成功構建lps誘導的ali模型,觀察到此炎癥模型中mir-214的表達顯著上調,而a2ar蛋白的表達水平顯著降低,二者呈負相關關系;在此模型中聯(lián)合應用a2ar激動劑及mir-214antagomir治療損傷小鼠,通過he染色、免疫組織化學和real-timepcr的方法證實聯(lián)合應用治療效果優(yōu)于單獨作用。通過上述細胞及動物實驗證實:miR-214具有促炎作用,綜合使用激活A2AR和抑制mi R-214表達的方法更有益于控制炎癥反應。以上的研究成果表明,mi R-214/A2AR負反饋調控環(huán)路在炎癥模型中具有促炎作用:炎癥及損傷中,炎性細胞中miR-214表達上調,在轉錄后水平抑制A2AR的表達;A2AR表達下降減弱了其通過PKA對NF-κB的抑制,即A2AR的抑炎作用減弱;反之,對NF-κB抑制的減弱促進其進一步上調mi R-214表達,從而放大了炎癥反應。我們的發(fā)現(xiàn)闡明了mi R-214與A2AR相互表達調控的分子機制,而且可以為下一步以mi R-214及A2AR為調節(jié)靶點來治療炎癥性疾病新策略的設計與實施提供理論依據(jù)。
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第三軍醫(yī)大學博士學位論文(2)PCR 引物由上海英駿生物技術有限公司合成。2.1.1.4 質粒(1)miRNA 雙螢光素酶報告基因載體 pmirGLO(Dual-Luciferase miRNA ession Vector)購于美國 Promega 公司。

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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R364.5

【參考文獻】

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1 李娜;王庚;金連弘;;腺苷受體信號通路和免疫細胞上腺苷受體的調節(jié)[J];細胞與分子免疫學雜志;2015年08期

2 何劍戈;任愛紅;施懿誠;侯小漫;趙義鴿;;肝缺血再灌注損傷的機制及其預防[J];河南科技大學學報(醫(yī)學版);2012年03期

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本文編號：2560228