【摘要】：炎癥(inflammation)是具有血管系統(tǒng)的機(jī)體對損傷因子所發(fā)生的一系列復(fù)雜的防御反應(yīng),具有殺滅病原體、限制感染及修復(fù)損傷等作用,是損傷、抗損傷和修復(fù)三為一體的統(tǒng)一過程。炎癥是伴隨多種疾病狀態(tài)下一種共有的復(fù)雜的病理現(xiàn)象,體表的外傷感染和各器官的大部分常見病和多發(fā)病(如肺炎、肝炎、腎炎等)都屬于炎癥性疾病。炎癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸取決于體內(nèi)各種促炎因素及抗炎因素在不同的環(huán)節(jié)、時(shí)相和過程相互作用和博弈時(shí)形成的復(fù)雜而又精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是否平衡。微小RNA(micro RNA,mi RNA)已被證實(shí)在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。和其他分子類似,miRNA也有抑炎和促炎之分。其中的miR-214,目前研究提示主要發(fā)揮促炎作用,其機(jī)制為延緩單核細(xì)胞的凋亡及維持T細(xì)胞的活化,但miR-214能否通過直接抑制某些抑炎基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)促炎尚無文獻(xiàn)報(bào)道。近年的研究表明,腺苷A2A受體(A2AR)活化后在外周組織通過抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放、中性粒細(xì)胞浸潤等在多種器官組織損傷和炎癥模型(如缺血性肝損傷、急性肺損傷、缺血再灌注損傷及急性腎損傷模型)中發(fā)揮顯著的抑制炎癥保護(hù)作用,但A2AR的蛋白表達(dá)水平卻在上述模型中表達(dá)下調(diào),這無疑制約了A2AR激動(dòng)劑的應(yīng)用。目前對A2AR自身表達(dá)調(diào)控對其抑炎作用的影響尚不清楚。鑒于mi R-214和A2AR在炎癥中均具有重要作用,那么A2AR的表達(dá)是否受到mi R-214的調(diào)控?mi RNA的加工和合成同樣受到其他分子的調(diào)控,A2AR的抑炎效應(yīng)是否包括抑制miR-214的表達(dá)?以上目前均未有相關(guān)報(bào)道。為了明確mi R-214與A2AR之間在炎癥中相互表達(dá)調(diào)控的作用機(jī)制及在炎癥中的作用:在本課題中,我們首先使用生物信息學(xué)預(yù)測,篩選出mi R-214為研究對象,在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中,借助miR-214 mimic觀察對A2AR蛋白和mRNA表達(dá)的影響,然后利用報(bào)告基因分析解析A2AR基因3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)與mi R-214的結(jié)合位點(diǎn)。然后,我們猜測A2AR反過來也可能調(diào)控mi R-214的表達(dá),使用A2AR的激動(dòng)劑CGS21680和拮抗劑ZM241385、PKA抑制劑H89和NF-κB抑制劑BAY 11-7082處理小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDMs)和RAW264.7細(xì)胞,觀察對mi R-214表達(dá)的影響,探討了可能涉及的主要信號通路。最后,在bmdms中過表達(dá)mir-214檢測對炎癥因子tnf-α和il-6表達(dá)的影響,借助脂多糖(lps)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(ali)模型,觀察a2ar蛋白和mir-214的表達(dá)相關(guān)性以及聯(lián)合應(yīng)用a2ar激動(dòng)劑和mir-214抑制劑對小鼠ali模型傷情的影響。主要取得了以下研究結(jié)果:1.利用targetscan、miranda和mirmap生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測可能調(diào)控a2ar的mirna,發(fā)現(xiàn)在3'-utr有mir-214潛在的結(jié)合位點(diǎn);在raw264.7細(xì)胞中,借助mir-214mimic過表達(dá)mir-214,westernblot和real-timepcr證實(shí),mir-214可以在蛋白水平而不是mrna水平抑制a2ar的表達(dá);構(gòu)建含a2ar3'-utr的報(bào)告基因載體,使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)合定點(diǎn)突變,詳細(xì)解析了a2ar3'-utr與mir-214結(jié)合的精確位點(diǎn);進(jìn)行功能回復(fù)實(shí)驗(yàn),向轉(zhuǎn)染了mimic的細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染不含3'-utr的a2ar真核表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)一步確定mir-214是通過與a2ar3'-utr的特異性結(jié)合來調(diào)控其表達(dá)。以上結(jié)果提示a2ar是mir-214的另一靶基因。2.生物信息學(xué)預(yù)測在mir-214啟動(dòng)子區(qū)-1000~+200存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子nf-κb可能的結(jié)合位點(diǎn);據(jù)此構(gòu)建了包含不同長度的mir-214啟動(dòng)子區(qū)luc報(bào)告基因載體并結(jié)合定點(diǎn)突變,luc報(bào)告基因檢測顯示nf-κb的激活能夠促進(jìn)mir-214啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性;結(jié)合染色質(zhì)免疫沉淀(chip)實(shí)驗(yàn)證實(shí)nf-κb的p65亞基特異性的與mir-214啟動(dòng)子區(qū)-490~-481和-27~-16結(jié)合。在raw264.7細(xì)胞中,借助a2ar激動(dòng)劑和拮抗劑,pka和nf-κb抑制劑,經(jīng)westernblot檢測,a2ar活化后通過pka途徑抑制iκbα的磷酸化進(jìn)而抑制nf-κbp65亞基的核轉(zhuǎn)位從而抑制nf-κb通路;在bmdms和raw264.7中證實(shí)激活a2ar后通過pka-nf-κb途徑下調(diào)mir-214表達(dá),經(jīng)emsa和chip-qpcr證實(shí)可能的機(jī)制是a2ar的活化使nf-κbp65的核轉(zhuǎn)位受到抑制,減弱其與mir-214啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合從而降低了轉(zhuǎn)錄活性。以上結(jié)果闡明了a2ar下調(diào)mir-214表達(dá)的分子機(jī)制,綜合1中結(jié)果,初步提示在細(xì)胞炎癥模型中存在mir-214/a2ar負(fù)反饋調(diào)控環(huán)路。3.通過在bmdms中轉(zhuǎn)染mir-214agomir和lps處理,構(gòu)建了mir-214過表達(dá)的細(xì)胞炎癥模型,借助real-timepcr和elisa方法檢測mir-214過表達(dá)促進(jìn)了tnf-α和il-6的表達(dá);成功構(gòu)建lps誘導(dǎo)的ali模型,觀察到此炎癥模型中mir-214的表達(dá)顯著上調(diào),而a2ar蛋白的表達(dá)水平顯著降低,二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;在此模型中聯(lián)合應(yīng)用a2ar激動(dòng)劑及mir-214antagomir治療損傷小鼠,通過he染色、免疫組織化學(xué)和real-timepcr的方法證實(shí)聯(lián)合應(yīng)用治療效果優(yōu)于單獨(dú)作用。通過上述細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí):miR-214具有促炎作用,綜合使用激活A(yù)2AR和抑制mi R-214表達(dá)的方法更有益于控制炎癥反應(yīng)。以上的研究成果表明,mi R-214/A2AR負(fù)反饋調(diào)控環(huán)路在炎癥模型中具有促炎作用:炎癥及損傷中,炎性細(xì)胞中miR-214表達(dá)上調(diào),在轉(zhuǎn)錄后水平抑制A2AR的表達(dá);A2AR表達(dá)下降減弱了其通過PKA對NF-κB的抑制,即A2AR的抑炎作用減弱;反之,對NF-κB抑制的減弱促進(jìn)其進(jìn)一步上調(diào)mi R-214表達(dá),從而放大了炎癥反應(yīng)。我們的發(fā)現(xiàn)闡明了mi R-214與A2AR相互表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制,而且可以為下一步以mi R-214及A2AR為調(diào)節(jié)靶點(diǎn)來治療炎癥性疾病新策略的設(shè)計(jì)與實(shí)施提供理論依據(jù)。
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文(2)PCR 引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。2.1.1.4 質(zhì)粒(1)miRNA 雙螢光素酶報(bào)告基因載體 pmirGLO(Dual-Luciferase miRNA ession Vector)購于美國 Promega 公司。

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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R364.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李娜;王庚;金連弘;;腺苷受體信號通路和免疫細(xì)胞上腺苷受體的調(diào)節(jié)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年08期

2 何劍戈;任愛紅;施懿誠;侯小漫;趙義鴿;;肝缺血再灌注損傷的機(jī)制及其預(yù)防[J];河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年03期

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本文編號：2560228