【摘要】：由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的結(jié)核病仍然是世界上最致命的傳染性疾病之一。全球約有三分之一的人口潛伏感染結(jié)核病。在2013年,全球大約有900萬人患結(jié)核病,其中中國患者約占總比例數(shù)的11%；另外還有150萬結(jié)核病患者死亡,其中36萬人為結(jié)核病和艾滋病毒共感染患者。據(jù)統(tǒng)計(jì),在2013年,全球約有48萬人患耐多藥結(jié)核病,其中約有9.0%的耐多藥結(jié)核病患者罹患廣泛耐藥結(jié)核病。這些觸目驚心的數(shù)字表明結(jié)核分枝桿菌是人類最難對(duì)付的致病菌之一。結(jié)核分枝桿菌之所以有如此大的破壞力,是因?yàn)槠湓谒拗骶奘杉?xì)胞內(nèi)成功的生存策略,而這主要?dú)w功于該菌釋放的效應(yīng)分子(或毒力因子)。結(jié)核分枝桿菌的效應(yīng)分子包含各類脂質(zhì)和分泌蛋白。目前鑒定出來的效應(yīng)分子主要分為三類：(1)能增強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌抵抗宿主產(chǎn)生的殺菌復(fù)合物,如KatG、SodC和AhpC；(2)能阻斷吞噬體成熟過程,如PtpA.PknG和SapM；(3)能抑制宿主細(xì)胞的凋亡,如NuoG和SodA。但這些效應(yīng)分子還無法完全解析結(jié)核分枝桿菌的致病性；因此,鑒定和研究新的效應(yīng)分子仍是當(dāng)前工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。基于以上現(xiàn)狀,本論文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究。首先,本文介紹了一種綜合性的新型生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)參與宿主-病原菌相互作用的結(jié)核分枝桿菌關(guān)鍵性分泌蛋白。我們利用聚類分析方法按以下標(biāo)準(zhǔn)盡可能多地收集已有的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)：(a)攻擊巨噬細(xì)胞后結(jié)核分枝桿菌的基因表達(dá)和DNA芯片數(shù)據(jù)；(b)利用全基因組插入誘變技術(shù)鑒定不同條件下基因的必需性數(shù)據(jù)；(c)攻擊動(dòng)物模型后結(jié)核分枝桿菌基因表達(dá)數(shù)據(jù)；(d)結(jié)核病患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌基因表達(dá)數(shù)據(jù)；(e)結(jié)核分枝桿菌臨床菌株丟失的基因數(shù)據(jù)；(f)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)；(g)結(jié)核分枝桿菌與宿主及宿主腸道菌群蛋白質(zhì)組的非同源性分析數(shù)據(jù)。然后按照不同標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行全基因組計(jì)分、排序?qū)⒉煌瑪?shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)整合起來。接著我們預(yù)測(cè)到結(jié)核分枝桿菌中54個(gè)潛在的與宿主相互作用的關(guān)鍵性分泌蛋白。這些蛋白質(zhì)符合以下特征：在結(jié)核分枝桿菌感染過程中上調(diào)表達(dá),結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)存活而非胞外存活所必須,在臨床菌株中保守存在,定位于細(xì)菌胞外,與宿主及宿主腸道菌群蛋白質(zhì)組沒有同源物。最后我們探討了這些分泌蛋白進(jìn)一步深入研究的可能性和重要性,為抗結(jié)核藥物的開發(fā)提供了可供選擇的平臺(tái)。接著,我們選擇一個(gè)可能的分泌蛋白R(shí)v3402c進(jìn)行了深入細(xì)致的分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)方面的研究,本文重點(diǎn)研究了Rv3402c與宿主巨噬細(xì)胞之間的相互作用。首先我們構(gòu)建了能夠表達(dá)Rv3402c蛋白的重組恥垢分枝桿菌(簡(jiǎn)寫為MS_Rv3402c)和空載體重組恥垢分枝桿菌(簡(jiǎn)寫為MS_Vec)。利用蛋白酶敏感性分析實(shí)驗(yàn)和Western blot首次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Rv3402c蛋白是一個(gè)分泌蛋白。接著發(fā)現(xiàn)重組菌MS_Rv3402c在巨噬細(xì)胞中的存活率顯著增加,且該重組菌能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的裂解死亡。重組菌MS_Rv3402c和對(duì)照菌MS_Vec在無菌培養(yǎng)基中顯示出相同的生長速率,而且各自的抗壓能力也不相上下,這暗示MS_Rv3402c胞內(nèi)存活能力的增強(qiáng)可能是Rv3402c蛋白干擾宿主細(xì)胞先天免疫應(yīng)答的結(jié)果。ELISA以及半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MS_Rv3402c刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性因子TNF-α和IL-1β的能力明顯高于MS_Vec。我們利用純化的Rv3402c蛋白也佐證了這些細(xì)胞因子是特異性地由該蛋白介導(dǎo)產(chǎn)生的。通過信號(hào)通路抑制劑實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)NF-κB, ERK1/2和p38信號(hào)途徑對(duì)于Rv3402c誘導(dǎo)的TNF-α分泌是必需的。不過只有NF-κB和ERK1/2信號(hào)通路是Rv3402c誘導(dǎo)的IL-1β分泌所需的,而p38途徑對(duì)其分泌沒有影響。這說明Rv3402c刺激這兩種細(xì)胞因子分泌的信號(hào)途徑可能存在差異。以上結(jié)果揭示Rv3402c可能通過干擾宿主的信號(hào)途徑來擾亂宿主的免疫應(yīng)答,最終導(dǎo)致細(xì)菌的胞內(nèi)存活率提高以及巨噬細(xì)胞的加速裂解死亡。最后,本文研究了結(jié)核分枝桿菌中著名的分泌性效應(yīng)分子PtpA(蛋白酪氨酸磷酸酶A)的調(diào)控蛋白PtkA(蛋白酪氨酸激酶A)的一些重要功能。序列比對(duì)結(jié)果顯示,PtkA最開始被認(rèn)為是鹵酸脫鹵酶超家族的一員。不過通過生物化學(xué)方法分析其酶活性后發(fā)現(xiàn)該蛋白是一個(gè)蛋白酪氨酸激酶,且能磷酸化PtpA并調(diào)控其磷酸酶酶活性。我們首先聯(lián)合體外蛋白激酶實(shí)驗(yàn)和放射性雙向電泳技術(shù)鑒定PtkA的底物,意外地發(fā)現(xiàn)了PtkA的上游調(diào)控蛋白,該蛋白能夠抑制PtkA的激酶活性。雖然目前還不能確定是哪個(gè)蛋白發(fā)揮抑制作用,但我們推測(cè)這極有可能是至今仍未見報(bào)道PtkA其它底物的主要原因。實(shí)驗(yàn)過程中,我們優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的重組PtkA蛋白及體外蛋白激酶實(shí)驗(yàn)條件,然后利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)到8個(gè)潛在的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)。通過一系列生物化學(xué)方法體外證明了TrxB2是PtkA在結(jié)核分枝桿菌中除自身及PtpA以外的第三個(gè)蛋白酪氨酸激酶底物,其磷酸化殘基為32位的酪氨酸。根據(jù)序列比對(duì)信息發(fā)現(xiàn),結(jié)核分枝桿菌的TrxB2和惡臭假單胞菌(P.putida)中的同源蛋白TrxB2的磷酸化酪氨酸殘基是相同位置,且磷酸化酪氨酸殘基附近的氨基酸同源性也相當(dāng)高。該結(jié)果從而也驗(yàn)證了細(xì)菌之間磷酸化位點(diǎn)的保守性。通過酶活分析以及western blot等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PtkA對(duì)TrxB2的磷酸化作用不影響后者的酶活性,但能抑制TrxB2的分泌；也就是說結(jié)核分枝桿菌H37Rv ΔptkA突變株分泌了更多的TrxB2到細(xì)菌細(xì)胞外。本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表的反向遺傳學(xué)數(shù)據(jù)顯示,體外培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌H37Rv AptkA突變株比野生株更加耐受H202和氫過氧化枯烯。鑒于TrxB2是一個(gè)硫氧還蛋白還原酶,文獻(xiàn)報(bào)道它能中和氧化壓力。因此,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以解釋這一現(xiàn)象：結(jié)核分枝桿菌H37Rv ΔptkA突變株分泌了更多的TrxB2到細(xì)胞外,TrxB2獨(dú)自或與TrxC共同對(duì)H202和氫過氧化枯烯進(jìn)行了中和解毒作用,從而使該突變株更加耐受這些氧化壓力。但是這一過程對(duì)于結(jié)核分枝桿菌自身的代謝或生存的意義還有待進(jìn)一步研究�？傊�,本文預(yù)測(cè)了一批潛在的抗結(jié)核藥物靶點(diǎn),確定了Rv3402c作為結(jié)核分枝桿菌效應(yīng)蛋白的事實(shí)并拓展了人們對(duì)結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.911

【參考文獻(xiàn)】

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1 戴燦;苗聰秀;盧光t;;基于重疊延伸PCR法的定點(diǎn)突變技術(shù)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年03期

2 李武;王洪海;謝建平;;分枝桿菌分泌系統(tǒng)[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2010年08期

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本文編號(hào)：2553889