【摘要】：熒光材料在生物成像領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用,選擇合適的熒光材料作為指示信號也就成為了研究中的重點和難點。熒光材料需要滿足熒光強度高,耐漂白,毒性小,體積小等要求。目前,常用的熒光材料主要包括:有機(jī)熒光探針、熒光蛋白、和量子點。本論文圍繞熒光材料應(yīng)用于HIV-1病毒基因組成像展開,取得以下主要進(jìn)展:1)為了研究HIV-1在侵染宿主細(xì)胞早期階段中的解離過程,我們構(gòu)建了三種有侵染能力的雙色熒光病毒(HIVRu-TC,HIVRu-EGFP,HIVTC-EGFp)和一種有侵染能力的三色熒光病毒(HIVRu-TC-ECFP)。結(jié)合這些多色熒光病毒顆粒和單顆粒成像技術(shù),就可以追蹤并觀測到HIV-1的基質(zhì)蛋白,衣殼蛋白以及基因組RNA在活細(xì)胞內(nèi)的分離的全過程。在HIV-1早期侵染階段,病毒顆粒多步解離過程首次被可視化觀察到,我們采用最直觀的方法解決了一個一直以來十分具有爭議的問題。2)為了延遲釕的有機(jī)金屬配合物的光漂白問題。我們在病毒顆粒的Vpr蛋白的C端插入了六個半胱氨酸,經(jīng)過病毒的組裝過程,這六個半胱氨酸與病毒基因組RNA相結(jié)合,通過自身的還原性來延遲釕的配合物的光漂白�；谶@一光漂白的延遲效果,對HIV-1病毒顆粒進(jìn)行單色基因組RNA的熒光標(biāo)記,就可以在不改造病毒衣殼CA蛋白并且不影響病毒侵染能力的情況下,對病毒的脫殼過程進(jìn)行成像。3)為了實現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)HIV-1前病毒基因組的可視化成像,我們利用量子點(QDs)對TALE和CRISPR體系進(jìn)行熒光標(biāo)記,從而實現(xiàn)對靶向基因序列的識別和定位,同時解決單拷貝基因序列在活細(xì)胞內(nèi)成像的技術(shù)難題。
【圖文】：

ＨＩＶ基因組全長大約９．８邋Ｋｂ，共編碼三個聚合蛋白（Ｅｎｖ，Ｐｏ丨和Ｇａｇ）和逡逑六個輔助蛋白（Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ和Ｎｅｆ），及兩個長末端重復(fù)序列（ＬＴＲ）逡逑（圖１－２）。Ｅｎｖ邋ｍＲＮＡ被表達(dá)并翻譯成ｇＰＩ６０，然后由蛋白酶裂解為表面區(qū)逡逑（ｇｐｌ２０）和跨膜區(qū)（ｇＰ４１）兩部分。ｇＰ１２０負(fù)責(zé)與受體ＣＤ４和輔助受體相結(jié)合，，逡逑而ｇｐ４１誘導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜相融合。Ｐｏｌ編碼病毒蛋白酶（ＰＲ）、逆轉(zhuǎn)錄酶（ＲＴ）逡逑和整合酶（ＩＮ）。Ｇａｇ編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白：基質(zhì)蛋白（ｐｌ７ＭＡ）、衣殼蛋白（ｐ２４逡逑ＣＡ）、核衣殼蛋白（ｐ７ＮＣ）、ｐ６和間隔胎ＳＰ１、ＳＰ２。Ｇａｇ蛋白組裝形成病毒衣逡逑殼；并在病毒出芽期間或剛剛完成出芽過程后，在蛋白酶的水解作用下裂解成為逡逑不同組分，結(jié)構(gòu)產(chǎn)生很大變化并獲得重要的生命功能［１７＿２２】。逡逑２逡逑

由Ｅｎｖ蛋白的負(fù)電性與細(xì)胞膜表面的一些正電性基團(tuán)相結(jié)合。通過任何因素，逡逑都使ＨＩＶ－１病毒顆粒表面的Ｅｎｖ蛋白與細(xì)胞表面病毒的受體ＣＤ４和共同受體相逡逑互接近，進(jìn)而增加ＨＩＶ－１病毒對對宿主細(xì)胞的侵染效率（圖１－３）邋［３４’。逡逑３逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TQ422;R373

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3 董r

本文編號：2538396