【摘要】：登革熱是由登革熱病毒(Dengue viruses, DENVs)引起的一種急性熱性傳染病。近年來,隨著登革熱流行的日益嚴(yán)重,對登革熱病毒進(jìn)行有效的防治是全世界共同關(guān)注的問題。目前并無臨床可用的特異性預(yù)防與治療藥物。近期登革熱疫苗Dengvaxia(?)首獲墨西哥當(dāng)局批準(zhǔn),成為全球第一個登革熱疫苗產(chǎn)品,但該疫苗還尚未在全球推廣和應(yīng)用。本研究成功建立了兩個檢測方法和一個小鼠感染模型。并以此為基礎(chǔ),首次在BABL/c小鼠模型開展核酸類藥物L(fēng)E-PolylCLC (Liposome-PolylCLC)抗登革熱Ⅱ型病毒感染的研究。本研究共分為四個部分：一、登革熱Ⅱ型病毒感染小鼠血清抗體的檢測提取并擴(kuò)增DENV2 NGC毒株EⅢ基因片段,將其克隆至原核表達(dá)載體2EASY(?)-Blunt E1。在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)出大小約為17 KD的EⅢ重組蛋白,將以包涵體形式表達(dá)的蛋白使用稀釋復(fù)性的方法進(jìn)行復(fù)性,濃縮,過柱純化。將純化的重組蛋白免疫小鼠,獲得EⅢ重組蛋白的多克隆抗體血清。間接免疫熒光顯示獲得的多克隆抗體血清可與DENV2病毒發(fā)生特異性反應(yīng)。進(jìn)一步應(yīng)用純化的EⅢ重組蛋白建立了間接ELISA方法。并使用該方法對DENV2感染小鼠血清樣本的抗體水平進(jìn)行檢測。二、登革熱Ⅱ型病毒感染小鼠腦組織病毒滴度的測定根據(jù)DENV2 NGC毒株E基因序列,設(shè)計一對特異性引物和TaqMan探針。建立了DENV2 TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。以構(gòu)建的2EASY-T1-E重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,其R值為0.98,Eff值為122.53%,說明該方法比較準(zhǔn)確可靠。該方法的最小檢測量為100拷貝／反應(yīng),具有較高的靈敏性。批內(nèi)和批間樣品的變異系數(shù)分別為0.53～1.90%和0.85～2.54%,該方法重復(fù)性也比較好。進(jìn)一步使用該方法對DENV2感染小鼠腦組織樣本的病毒含量進(jìn)行測定。三、登革熱Ⅱ型病毒小鼠感染模型的建立成功建立了DENV Ⅱ型病毒NGC毒株BABL/c小鼠腦內(nèi)注射感染模型。NGC毒株以1×106pfu的病毒量腦內(nèi)注射感染BABL/c小鼠。小鼠被病毒感染后體重下降并呈現(xiàn)出后肢癱瘓、皮膚出血等臨床發(fā)病癥狀,感染后第9天癥狀最為嚴(yán)重并出現(xiàn)死亡,并且小鼠腦組織存在明顯的病理損傷。對小鼠腦組織的病毒含量進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)病毒可在小鼠腦部復(fù)制和增殖,并在感染后第9天達(dá)到峰值。小鼠還能夠產(chǎn)生相應(yīng)的抗體來中和病毒,在感染后第21天抗體水平達(dá)到最高。四、LE-PolylCLC在小鼠模型中抗登革熱Ⅱ型病毒感染的研究按1 mg/kg的用藥劑量靜脈注射LE-PolylCLC能夠提高感染DENV2小鼠的存活率,減輕臨床發(fā)病癥狀及對腦組織的病理損傷。LE-PolylCLC能夠有效抑制DENV2在小鼠腦部的增殖,Western blotting以及間接免疫熒光數(shù)據(jù)也進(jìn)一步驗證了該結(jié)論。LE-PolylCLC通過靜脈注射給藥途徑發(fā)揮的藥效要優(yōu)于其它給藥途徑。LE-PolylCLC藥效發(fā)揮可能主要通過上調(diào)與天然免疫相關(guān)的IFN-y等細(xì)胞因子的表達(dá),并且小鼠血清中抗體水平也有一定程度的升高。另外,LE-PolyICLC在該模型中抗DENV2的效果要優(yōu)于PolylCLC。
[Abstract]:Dengue fever is an acute febrile infectious disease caused by Dengue virus (DENVs). In recent years, with the increasing prevalence of dengue fever, the effective prevention and treatment of dengue virus is a common concern of the whole world. Currently, there is no clinically available specific prevention and treatment drug. Dengue vaccine, Dengvaxia (? ) The first Mexican authorities have been approved by the Mexican authorities to be the world's first dengue vaccine product, but the vaccine has not yet been extended and applied globally. Two detection methods and a mouse infection model were successfully established in this study. On the basis of this, the first time in the BABL/ c mouse model, the study of the anti-dengue type 鈪，

本文編號：2479256