【摘要】：研究背景Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)及維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體(RIG-1-like receptors,RLRs)等識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)后,可通過募集多種不同接頭分子,激活TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)�；罨腡BK1磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory 3,IRF3),促進(jìn)其二聚化及核內(nèi)轉(zhuǎn)位,進(jìn)而形成有活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體,啟動Ⅰ型干擾素(IFNα/β)基因轉(zhuǎn)錄。Ⅰ型干擾素可與Ⅰ型干擾素受體結(jié)合,通過JAK-STAT通路,誘導(dǎo)多種抗病毒基因的表達(dá)。因此,TBK1作為Ⅰ型干擾素產(chǎn)生所必需的關(guān)鍵激酶,其適度活化對機體抗病毒免疫及維持免疫穩(wěn)態(tài)均非常重要。已有報道,多個E3泛素連接酶可通過促進(jìn)TBK1泛素化,調(diào)控TBK1表達(dá)及活化;然而去泛素化酶及其介導(dǎo)的去泛素化,對TBK1表達(dá)及活化的影響尚不清楚。泛素特異性蛋白酶1(ubiquitin specific peptidase,USP1)是泛素特異性蛋白酶家族中的一員,能夠去除一系列底物的泛素化修飾,進(jìn)而參與調(diào)控多種信號通路。USP1 可與 USP1 相關(guān)因子 1(USP1-associatedfactor1,UAF1)結(jié)合形成一個去泛素化酶復(fù)合體,并顯著增強USP1的去泛素化酶活性。USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體通過去除其靶分子的泛素化修飾,參與多個信號通路的調(diào)控,如調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)過程和腫瘤發(fā)生過程等。然而,USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體在免疫系統(tǒng),特別是固有抗病毒免疫反應(yīng)中的作用,尚不清楚。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)病毒感染可誘導(dǎo)USP1和UAF1的表達(dá);USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體可抑制TLR3/4和RIG-I介導(dǎo)的IRF3活化以及后續(xù)的IFN-β的分泌。USP1、UAF1均可特異性結(jié)合TBK1,并去除其K48位偶聯(lián)的泛素化修飾,進(jìn)而穩(wěn)定TBK1的蛋白表達(dá)。同時,USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體的特異性抑制劑ML323,可抑制TBK1蛋白表達(dá)及IFN-β分泌。小鼠病毒感染模型中,ML323處理抑制抗病毒固有免疫反應(yīng),并促進(jìn)病毒復(fù)制。本研究為TBK1活化提出了新的調(diào)控機制;USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體可能作為潛在靶點,用于病毒感染性疾病等的防治。材料和方法1.USP1-UAF1對IFN-β表達(dá)的影響1.1.USP1-UAF1特異性抑制劑ML323不同濃度(0,15,30,60 μM.)預(yù)處理小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞4h后,仙臺病毒(Sendai virus,SeV)感染12h,ELISA檢測IFN-β的分泌情況。1.2.設(shè)計合成分別針對USP1、UAF1的特異性干擾RNA(siRNA),使用脂質(zhì)體Interferin將siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞,36h后,分別用LPS、poly(I:C)刺激或SeV感染細(xì)胞,ELISA檢測IFN-β、TNF-α及IL-6的分泌情況。1.3.構(gòu)建USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒,使用脂質(zhì)體JetPEI將USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒及相關(guān)報告基因質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞;24h后,分別用LPS、poly(I:C)刺激或SeV感染細(xì)胞,報告基因檢測IFN-β及NF-κB報告基因活化情況。1.4.分別用SeV感染或IFN-β刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞不同時間,Western blot檢測USP1和UAF1的表達(dá)變化。2.USP1-UAF1對IRF3活化的影響2.1.利用脂質(zhì)體JetPEI將分別USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒及不同接頭分子,與IRF3或NF-κB報告基因質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞。報告基因檢測由TRIF、TBK1介導(dǎo)的IRF3報告基因活化情況,以及由Myd88、TRIF、RIG-I介導(dǎo)的NF-κB報告基因活化情況。2.2.利用脂質(zhì)體Interferin分別將USP1、UAF1 siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞;36h后,分別用LPS刺激或SeV感染細(xì)胞;Western blot檢測IRF3及STAT1的磷酸化變化。3.USP1-UAF1與TBK1的相互作用3.1.利用脂質(zhì)體JetPEI將USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒及不同接頭分子,與IFN-β報告基因質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞;報告基因檢測由RIG-I、MDA5、MAVS、TRIF、TBK1、IRF3-5D介導(dǎo)的IFN-β報告基因活化情況。將USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒及TBK1,分別與IRF3、ISRE或NF-κB報告基因質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞;報告基因檢測由TBK1介導(dǎo)的IRF3、ISRE、NF-κB報告基因活化情況。3.2.LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞不同時間點,Western Blot檢測USP1、UAF1的表達(dá)情況及USP1細(xì)胞內(nèi)定位變化。3.3.利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將USP1或UAF1表達(dá)質(zhì)粒同多個接頭分子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中,培養(yǎng)24h后,利用免疫共沉淀結(jié)合Western Blot檢測USP1、UAF1與TLR/RLR信號通路中的不同分子的結(jié)合情況。3.4.LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞不同時間點,利用免疫共沉淀結(jié)合Western Blot檢測USP1、UAF1與TBK1、IRF3等分子的內(nèi)源性結(jié)合情況。4.USP1-UAF1對TBK1泛素化及蛋白表達(dá)的影響4.1.利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將TBK1、Ub或K48-Ub表達(dá)質(zhì)粒,分別與USP1野生型質(zhì)粒、USP1去泛素化酶功能缺失突變體USP1-C90S或UAF1表達(dá)質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,利用免疫共沉淀結(jié)合Western Blot檢測USP1、USP1C90S、UAF1對TBK1泛素化的影響。4.2.利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別將不同劑量的USP1、UAF1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中,培養(yǎng)24h后,Western Blot檢測不同劑量USP1、UAF1對TBK1及IRF3蛋白表達(dá)的影響。4.3.USP1-UAF1特異性抑制劑ML323預(yù)處理小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞4h后,LPS刺激不同時間點,Western Blot檢測TBK1的表達(dá)情況。4.4.利用脂質(zhì)體Interferin分別將USP1、UAF1 siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞;36h后,分別用LPS刺激或SeV感染細(xì)胞,Western Blot檢測TBK1表達(dá)情況。4.5.ML323預(yù)處理小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,LPS刺激4小時后,蛋白合成酶抑制劑CHX作用不同時間點,Western Blot檢測TBK1的表達(dá)情況。5.USP1-UAF1復(fù)合體在體內(nèi)和體外情況下對病毒誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的調(diào)控5.1.ML323處理小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,ELISA檢測病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-β;RT-PCR檢測IFN-β和下游響應(yīng)基因mRNA水平,以及細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制情況。5.2.C57BL/6(雄性,8周)小鼠腹腔注射淀粉誘導(dǎo)腹腔原代巨噬細(xì)胞。三天后利用DMSO或ML323處理,隨后VSV病毒感染小鼠12小時。ELISA檢測小鼠腹腔滲出液中IFN-β的含量;5.3.C57BL/6(雄性,8周)小鼠腹腔注射ML323(10mg/kg),4小時后再腹腔注射水胞性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)。8小時取外周血,ELISA檢測血清中IFN-β的含量;RT-PCR檢測肝、肺、脾組織中IFN-β的mRNA水平和VSV病毒復(fù)制情況。5.4.C57BL/6(雄性,8周)小鼠腹腔注射DMSO或ML323(10mg/kg)預(yù)處理,接著腹腔注射水胞性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)。18小時取肺組織進(jìn)行石蠟包埋切片進(jìn)行HE染色。研究結(jié)果1.USP1-UAF1 增強 IFN-β的表達(dá)ML323可以顯著降低由SeV介導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IFN-β的分泌,且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性;利用USP1、UAF1 siRNA處理明顯降低小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中LPS、poly(I:C)、SeV誘導(dǎo)的IFN-β分泌。USP1、UAF1過表達(dá)可顯著提高RAW267.4細(xì)胞中LPS、poly(I;C)、SeV介導(dǎo)的IFN-β報告基因活性,但對NF-1κB報告基因活性沒有明顯影響。2.USP1-UAF1增強IRF3的活化USP1、UAF1高表達(dá)均可顯著增強由TRIF、TBK1介導(dǎo)的IRF3報告基因活性,但是對于MyD88、TRIF、RIG-I介導(dǎo)的NF-κB報告基因活性沒有明顯影響;USP1、UAF1基因沉默顯著降低小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中LPS、SeV介導(dǎo)的IRF3及STAT1的磷酸化。3.USP1-UAF1 與 TBK1 結(jié)合TBK1與USP1或UAF1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293T,免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)TBK1與USP1、UAF1均可結(jié)合。小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞中,TBK1可與USP1和UAF1內(nèi)源性結(jié)合;TBK1與USP12和USP46均不結(jié)合。4.USP1-UAF1去除TBK1的K48位偶聯(lián)泛素化,穩(wěn)定其表達(dá)USP1、UAF1均可顯著降低TBK1泛素化及K48位偶聯(lián)的泛素化修飾;USP1、UAF1高表達(dá)可以顯著增加HEK293T細(xì)胞中TBK1的蛋白表達(dá),且呈現(xiàn)劑量依賴現(xiàn)象;USP1、UAF1基因沉默后,小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中TBK1蛋白表達(dá)明顯下降;加入CHX后ML323處理組細(xì)胞內(nèi)的TBK1含量明顯低于對照組。5.ML323增強固有抗病毒免疫反應(yīng)ML323處理顯著降低小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中VSV介導(dǎo)的IFN-β、ISG15的表達(dá),促進(jìn)VSV病毒復(fù)制;ML323處理可明顯降低VSV誘導(dǎo)的小鼠腹腔滲出液以及外周血中IFN-β的含量,同時小鼠肝、肺、脾組織內(nèi)IFN-βmRNA也明顯下降,相對的病毒復(fù)制量明顯提高。肺組織石蠟切片HE染色結(jié)果也顯示ML323處理組炎性細(xì)胞滲出情況較對照組更為明顯。結(jié)論1.USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體特異性結(jié)合TBK1,去除TBK1 K48位偶聯(lián)的泛素化修飾,抑制TBK1降解,進(jìn)而促進(jìn)TLR及RIG-I介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素表達(dá)。2.USP1-UAF1去泛素化酶特異性抑制劑ML323在小鼠病毒感染模型中,抑制機體抗病毒固有免疫反應(yīng),并促進(jìn)病毒復(fù)制。創(chuàng)新性及研究意義1.發(fā)現(xiàn)了特異性去除TBK1 K48偶聯(lián)的泛素化修飾的去泛素化酶USP1;揭示新的TBK1活化調(diào)控機制,豐富了對抗病毒固有免疫反應(yīng)調(diào)控的認(rèn)識。2.發(fā)現(xiàn)USP1-UAF1去泛素化酶特異性抑制劑ML323,抑制Ⅰ型干擾素表達(dá)及機體抗病毒免疫反應(yīng)。3.為USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體作為一個潛在的抗病毒藥物靶點提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李燾;劉朝奇;王雄偉;;泛素化在人表皮生長因子受體降解中的研究進(jìn)展[J];重慶醫(yī)學(xué);2012年04期

2 馬祖祥;趙維玲;李永柏;高曉潔;楊軍;孫平;李成榮;;特發(fā)性腎病綜合征患兒外周血單個核細(xì)胞泛素的表達(dá)及意義[J];中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2006年10期

3 王素霞;劉媛;吳慧娟;張志剛;;去泛素化酶的研究及其進(jìn)展[J];臨床與實驗病理學(xué)雜志;2008年06期

4 吳怡;劉新;;蛋白質(zhì)泛素化、去泛素化與腫瘤發(fā)生的關(guān)系[J];沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2008年01期

5 茅幸;張志剛;吳慧娟;;泛素特異性加工酶2的研究進(jìn)展[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2012年05期

6 何洪智;趙曉航;張立勇;吳e，

本文編號：2439806