【摘要】：目的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是一種螺旋狀的微需氧革蘭氏陰性細菌,生存于人類的胃粘膜表面,是目前唯一一種定殖于人胃部的病原菌。幽門螺桿菌的感染是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍的主要病因,并與胃癌、胃黏膜相關淋巴組織(MLAT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關。世界衛(wèi)生組織已將幽門螺桿菌列為第一類致癌因子,是胃癌的危險因素。目前,全球約一半的人口已感染幽門螺桿菌。所以,幽門螺桿菌的清除和感染治療是防治胃癌的有效手段。如今,國際上清除幽門螺桿菌的通用方法是三聯(lián)療法,即,使用膠體鉍劑或質子泵抑制劑,并同時并用兩種抗生素。常用的抗生素有:以克拉霉素為代表的大環(huán)內酯類抗生素;以甲硝唑為代表的硝基咪唑類抗生素;以阿莫西林為代表的β-內酰胺類抗生素等。克拉霉素是新一代大環(huán)內酯類抗生素,它在胃酸中表現(xiàn)穩(wěn)定,而且易于人體吸收,進而成為了治療幽門螺桿菌感染的最常用抗生素之一。然而,由于近年來國際上對抗生素的過量使用,使得細菌對抗生素的獲得性耐藥成為了引起幽門螺桿菌清除失敗的主要原因。尤其是克拉霉素的耐藥率,在國內外均處于上升趨勢。克拉霉素作用于核糖體大亞基上的23S rRNA,從而抑制蛋白質的合成而產生抑菌效果。所以目前,國際上對克拉霉素耐藥機制的研究主要集中在23SrRNA位點的點突變上。然而,也有一些研究表明,在一些克拉霉素的Hp耐藥株中,該點突變并不是造成克拉霉素耐藥的唯一因素近些年來大量研究發(fā)現(xiàn),對藥物吸收降低和藥物外排增加的機制也是細菌內在耐藥機制中的重要部分。目前已發(fā)現(xiàn)三種RND家族的外排泵系統(tǒng)存在于幽門螺桿菌中參與幽門螺桿菌的耐藥壓力,分別是hefABC和hefGHI基 因。除了外排泵系統(tǒng),在轉運蛋白中還有大量的包括吸收系統(tǒng)在內的各種轉運蛋白系統(tǒng),在細菌中行使著不同的轉運功能,它們是否參與幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥過程仍未有研究報導。我們通過實時定量PCR篩選出在克拉霉素壓力下的野生株和克拉霉素耐藥株中表達有變化的轉運蛋白基因HP0497,進而采用多種研究方法探討該基因在克拉霉素耐藥過程中的作用。本實驗研究主要目的在于,證實轉運蛋白HH0497參與幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥作用和其內在機制,并且還可能參與幽門螺桿菌的多耐藥特性。這為解決幽門螺桿菌乃至其他致病菌的多耐藥問題提供了新的思路,幫助找到新的藥物作用靶點,同時,也為抗生素在臨床的合理使用提供了有效指導。方法1、使用克拉霉素處理野生株Hp26695,提取mRNA,逆轉錄出cDNA后,進行qPCR,檢測出具有表達差異的轉運蛋白基因。將檢測出來的基因在克拉霉素耐藥株中篩查,用qPCR法找出同時具有表達差異的基因。2、以野生株Hp26695為親本構建基因敲除株△HP0497,以克拉霉素耐藥株為親本構建基因敲除株△HP0497-a。3、測定野生株Hp26695和△HP04497的生長曲線。4、測定野生株Hp26695和△HP0497對克拉霉素的生長抑制曲線。5、測定野生株Hp26695、△HP04和△HP0497-a對克拉霉素的最小抑菌濃度。6、激光共聚焦顯微鏡比較經(jīng)熒光標記的克拉霉素處理前后的野生株Hp26695和△HP0497存活率。7、測定野生株Hp26695、△HP0497和克拉霉素耐藥株在熒光積累試驗中熒光染料H33342的殘留量。8、測定轉運蛋白HP0497在克拉霉素臨床耐藥株和敏感株中的表達情況。9、在野生株Hp26695和△HP0497中測定外排泵系統(tǒng)基隊(hefABC,hefGHI)的表達量變化。結果1、轉運蛋白HP0497在經(jīng)克拉霉素處理的幽門螺桿菌野生株Hp26695中表達顯著升高,在克拉霉素耐藥株(實驗室誘導株)中表達也升高,預測轉運蛋白HP0497可能參與幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥機制。2、成功構建出以幽門螺桿菌野生株Hp26695為親本的基因敲除株△HP0497,以幽門螺桿菌克拉霉素耐藥株為親本的基因敲除株△HP0497-aa。3、對比△HP0497與WTHp26695的生長曲線,結果顯示敲除HP0497后不影響幽門螺桿菌的生長活力。4、對比△HP0497與WTHp26695的對克拉霉素的殺菌曲線、最小抑菌濃度、激光共聚焦圖片,表明敲除了 HP0497后幽門螺桿菌對克拉霉素的敏感性顯著升高。5、對比△HP0497與WTHp26695的熒光染料積累量,結果顯示敲除HP0497后幽門螺桿菌中染料H33342的積累量顯著升高。6、對比臨床克拉霉素耐藥株和敏感株中轉運蛋白HP0497的表達情況,結果顯示其在耐藥株的表達明顯高于敏感株。7、對比△HP0497與WTHp26695中外排泵系統(tǒng)(hefABC,hefHI)的表達情況,結果顯示敲除HP0497后,兩種外排系統(tǒng)表達顯著降低。結論轉運蛋白HP0497在幽門螺桿菌對克拉霉素適應的過程中起著重重重要作用,能夠通過一定的機制影響下游外排泵(hefABC,hefHI)的表達,有效排出克拉霉素,使得幽門螺桿菌在克拉霉素壓力下能減少損害,迅速適應壓力環(huán)境,為幽門螺桿菌的耐藥的產生提供了時間和物質基礎。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R378

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