【摘要】：季節(jié)性流感和大流行給人類的健康帶來巨大威脅。流感病毒是單股負鏈RNA病毒,屬于正粘科,分為三種類型,其中A型流感最為廣泛,危害最大。流感病毒表面血凝素(HA)分子是主要抗原,三維結(jié)構(gòu)為三聚體結(jié)構(gòu),52-277位保守的半胱氨酸將血凝素分子分為一個球狀頭部和桿狀莖部兩部分。HA球頭部含有唾液酸受體結(jié)合位點,介導病毒與受體細胞的結(jié)合,是誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要靶標。不同亞型HA頭部結(jié)構(gòu)域氨基酸不同,高度可變,針對HA球頭部的抗體特異性較強。HA桿狀莖部在所有HA亞型中相對保守,可誘導產(chǎn)生廣譜中和抗體,但由于莖部抗原表位的暴露較差,該類抗體的制備和篩選較為困難。目前廣譜中和抗體的研究與制備是流感抗體研究中的熱點。然而,傳統(tǒng)的血凝抑制與微量中和實驗很難快速篩選檢測出針對HA莖部保守區(qū)域的抗體。利用反向遺傳技術(shù),制備含有不同HA頭部和莖部的重組熒光報告流感病毒,通過頭莖互換HA流感熒光報告病毒的次序篩選,將能快速篩選得到針對保守莖部的廣譜中和抗體。前期我們實驗室成功拯救出一株攜帶Gaussia.luciferase熒光報告基因的流感病毒,命名為IAV-luc。IAV-luc是復制完全型病毒,能夠在感染的細胞和動物體內(nèi)穩(wěn)定表達熒光素酶。通過熒光素酶的檢測,能夠直觀、快速的檢測報告病毒的復制情況。本研究嘗試在IAV-luc背景下拯救攜帶不同亞型頭莖互換的HA熒光報告病毒,利用HA頭莖互換熒光流感病毒靶向HA莖部結(jié)構(gòu)域,開發(fā)一種高效、便捷、靈敏的高通量廣譜中和抗體篩選方法。本研究中,成功拯救出一系列的熒光流感病毒 H1-PR8/H1-CA09-luci,H1-PR8/H5-HK-luci,H9-HK/H1-PR8-luci,H1-CA09/H1-PR8-Luci,將頭莖互換熒光流感病毒與待測抗體孵育后,將混合液轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24h后加入腔腸素底物檢測報告病毒的熒光素酶的活性。熒光素酶活性的強弱直接反映出待檢測抗體對報告病毒的抑制程度,我們可以判斷出待檢抗體的結(jié)合部位及中和活性。本研究初步使用已知中和抗體4E6、CR9114、C179、8852等驗證頭莖互換熒光流感病毒的識別能力。結(jié)果顯示,4E6只能中和 H5-HK-luci,不能中和 H1-PR8/H5-HK-luci,而 CR9114、C179、8852對 H1-PR8-luci、H5-HK97-luci、H1-PR8/H5-HK 有中和活性,證實了 4E6 抗體識別H5-HA的頭部,CR9114、C179和8852則是識別莖部的廣譜中和抗體。綜上,本研究建立一種通過HA頭莖互換熒光報告流感病毒快速檢測莖部中和抗體的實驗方法。該方法首次將熒光素酶基團引入頭莖互換流感病毒中,大大提高針對HA莖部的廣譜中和抗體檢測的效率和靈敏度,為高通量篩選廣譜流感中和抗體提供可行的方案,為流感病毒的防治與流行病學調(diào)查提供新的思路。
[Abstract]:Seasonal influenza and pandemics pose a great threat to human health. Influenza virus is a single negative strand RNA virus, which belongs to orthomycology and is divided into three types. Type A influenza virus is the most widespread and harmful. The hemagglutinin (HA) molecule on the surface of influenza virus is the main antigen, and the three-dimensional structure is trimer structure. The conserved cysteine at the 52-277 position divides the hemagglutinin molecule into a spherical head and a rod-shaped stem. The head of the HA ball contains sialic acid receptor binding sites that mediate the binding of the virus to the receptor cells. It is the main target that induces the body to produce neutralizing antibody. The amino acids of different subtypes of HA head domain are different and highly variable, and the specificity of antibodies against the head of HA spheres is strong. The stem of HA rod is relatively conserved in all HA subtypes, which can induce the production of broad-spectrum neutralizing antibodies. However, because of the poor exposure of stem epitopes, it is difficult to prepare and screen these antibodies. At present, the research and preparation of broad spectrum neutralizing antibody is a hot spot in influenza antibody research. However, traditional hemagglutination inhibition and microneutralization experiments are difficult to quickly screen and detect antibodies against the conserved region of the stem of HA. Reverse genetic technique was used to prepare recombination fluorescent report influenza virus containing different HA heads and stems. By selecting the HA fluorescent report virus from head to stem, broad spectrum neutralizing antibodies against conserved stems could be obtained quickly. Earlier, our laboratory successfully rescued a influenza virus carrying the Gaussia.luciferase fluorescent reporter gene, named IAV-luc.IAV-luc, which is a replica complete virus that can stably express luciferase in infected cells and animals. The detection of luciferase can detect the replication of virus directly and quickly. In this study, we try to rescue the HA fluorescent reporter virus carrying different subtypes of capillaries in the background of IAV-luc, and use the HA capillaries to target the HA stem domain to develop an efficient and convenient one. A sensitive method for screening high throughput broad-spectrum neutralizing antibodies. In this study, we succeeded in saving a series of fluorescent influenza viruses H1-PR8 / H1-CA09-lucio H1-PR8 / H5-HK-lucignan H9-HKR / H1-PR8-luci-H1-CA09 / H1-PR8-Luci, After incubating the head stem exchange fluorescent influenza virus with the antibody to be tested, the mixture was transferred to the cell culture plate. After 24 hours of culture, the luciferase activity of the reported virus was detected by the addition of an enterin substrate. The activity of luciferase can directly reflect the inhibition degree of antibody to report virus, and we can judge the binding site and neutralization activity of antibody to be detected. In this study, we preliminarily used the known neutralizing antibody 4E6C9114C179T8852 to verify the recognition ability of the capillary-stem exchange fluorescent influenza virus. The results showed that 4E6 could only neutralize H5-HK-luci-luciand could not neutralize H1-PR8 / H5-HK-luci.And CR9114,C179,8852 had neutralizing activity for H1-PR8-luci-H5-HK97-luci-H1-PR8 / H5-HK, which confirmed that 4E6 antibody recognized the head of H5-HA and CR9114,. C179 and 8852 are broad-spectrum neutralizing antibodies that recognize stems. In conclusion, an experimental method for rapid detection of neutralizing antibodies in stems by HA head-stem exchange fluorescence was established. The luciferase group was introduced into the head stem swap influenza virus for the first time, which greatly improved the efficiency and sensitivity of the detection of broad-spectrum neutralizing antibody against HA stem, and provided a feasible scheme for high-throughput screening of broad-spectrum influenza neutralizing antibody. To provide a new idea for the prevention and control of influenza virus and epidemiological investigation.
【學位授予單位】：安徽大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：2404743