【摘要】：副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是重要的食源性致病菌,廣泛存在于海產(chǎn)品中,如果消費(fèi)者誤食用未經(jīng)加工或加工不徹底的海產(chǎn)品,可能會出現(xiàn)腸胃不適、腹瀉、嘔吐等癥狀。目前全球氣候變暖引起的海洋因子的變化以及各種惡劣氣候現(xiàn)象的出現(xiàn),促使海洋中各種致病細(xì)菌不斷進(jìn)化并完善自己的一套生存系統(tǒng),并發(fā)展出各種抵御外界惡劣環(huán)境的方式以獲得更大的存活可能,同時(shí)入侵和攻擊宿主。而外界環(huán)境中無論是自然環(huán)境還是海產(chǎn)品運(yùn)輸加工過程中,其中對海洋性微生物非常重要的影響因子有溫度、酸。本文針對低pH酸對副溶血性弧菌的脅迫所獲得的酸耐受性菌株,以此為材料從生物學(xué)特性、運(yùn)動性、生物膜形成能力、耐藥性和細(xì)胞毒性各個(gè)指標(biāo),結(jié)合轉(zhuǎn)錄組及蛋白組數(shù)據(jù)來分析比較出發(fā)菌株和酸耐受株之間的差異,分析和探討副溶血性弧菌生物學(xué)特性和抗逆耐受機(jī)制,為水產(chǎn)品儲藏、運(yùn)輸和加工過程可能帶來的微生物危害提供參考,為副溶血性弧菌風(fēng)險(xiǎn)評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。本論文主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.酸耐受菌株的獲得。將保存于-80°C甘油管的副溶血性弧菌經(jīng)過兩次活化一次純化后擴(kuò)大培養(yǎng)至對數(shù)中后期(OD600=0.6)的菌液作為工作菌液。將工作菌液在一系列酸值的培養(yǎng)基中進(jìn)行處理2h,通過經(jīng)典的倍比稀釋平板涂布法計(jì)算各個(gè)酸值培養(yǎng)基條件下副溶血性弧菌的存活數(shù),將存活數(shù)低于105CFU/mL的酸值條件選定為challenge pH(達(dá)到使人體感到不適的細(xì)菌數(shù)量),結(jié)果表明,在酸值pH=4的TSB 3%NaCl中處理2h后細(xì)菌存活數(shù)低于105個(gè)CFU/mL,即pH=4為challenge pH。后在challenge pH條件下進(jìn)行酸耐受定向培養(yǎng),直至其在challenge pH條件下細(xì)胞存活數(shù)高于105CFU/mL后,即為獲得酸耐受菌株。2.出發(fā)菌株與酸耐受菌株生物學(xué)特性、運(yùn)動性、生物膜形成能力、耐藥性及細(xì)胞毒性的差異比較。本章節(jié)通過比較出發(fā)菌株與酸耐受菌株其生物學(xué)特性、運(yùn)動性、生物膜形成能力、耐藥性及細(xì)胞毒性的變化,來初步了解酸耐受菌株在酸脅迫條件下表現(xiàn)的適應(yīng)機(jī)制。通過肉眼觀察菌落形態(tài),掃描電鏡觀察菌體個(gè)體形態(tài)和大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸耐受株菌落形態(tài)較出發(fā)菌株出現(xiàn)由中心向外周輻射的褶皺,且邊緣不光滑整齊,通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌落中出現(xiàn)空斑,而非均質(zhì)分布;通過掃描電鏡觀察兩株菌株外部形態(tài),發(fā)現(xiàn)均呈短桿狀,形態(tài)大小無明顯差異。細(xì)胞能動性實(shí)驗(yàn),即采用經(jīng)滅菌竹簽將單一菌落接種至能動平板上,37℃孵育20-24h,觀察細(xì)菌從接種點(diǎn)遷移形成的渾濁區(qū)域的大小,拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果(觀察并測量細(xì)菌從接種點(diǎn)遷移形成的渾濁區(qū)域的直徑大小),結(jié)果表明酸耐受菌株在泳動性能上較出發(fā)菌株出現(xiàn)顯著性提高,而在蹭行性和集群性運(yùn)動方面則無明顯差異。通過傳統(tǒng)結(jié)晶紫染色方法檢測出發(fā)菌株和酸耐受菌株生物膜形成能力的變化,通過在最大成膜時(shí)間點(diǎn)(72h)所形成生物膜量的差異來反應(yīng)成膜能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸耐受菌株較出發(fā)菌株在72h時(shí)所形成的生物膜量顯著減少,即生物膜形成能力明顯降低。根據(jù)clsi標(biāo)準(zhǔn)(美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化組織)將出發(fā)菌株與酸耐受菌株對18種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌株對青霉素類的氨芐有耐藥性,對氨基糖苷類的鏈霉素、卡那霉素,頭孢類的頭孢唑啉以及青霉素類的哌拉西啉四種藥物處于耐藥中介水平,對其它藥物均為敏感。而酸耐受菌株則對氨芐以及上述物種藥物均出現(xiàn)敏感,說明酸耐受菌株其耐藥性能下降。通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)來比較毒性變化。將caco-2細(xì)胞與細(xì)菌以數(shù)量比為1:100的比例進(jìn)行細(xì)胞侵染4h,通過兩種染料分別染色活細(xì)胞和死細(xì)胞,利用默克流式細(xì)胞儀分別進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞計(jì)數(shù),來檢測活細(xì)胞存活數(shù)率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),出發(fā)菌株對細(xì)胞侵染4h后,活細(xì)胞數(shù)量在11%左右,而相比之下,由酸耐受菌株對細(xì)胞侵染4h后,細(xì)胞存活數(shù)量在60%左右,存活數(shù)量明顯提高,說明酸耐受菌株對細(xì)胞的侵染及毒性降低。3.出發(fā)菌株與酸耐受株轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析、內(nèi)參篩選及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證。利用illuminahiseqtm2500高通量測序技術(shù)平臺對臨床分離的o3:k6血清型副溶血性弧菌大流行株及其酸耐受菌株高通量測序得到的轉(zhuǎn)錄文庫進(jìn)行比對分析,出發(fā)菌株和酸耐受菌株文庫分別獲得了1.61g和1.69g數(shù)據(jù)量。對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、拼接和組裝后共獲得4603個(gè)轉(zhuǎn)錄本,其中4447個(gè)轉(zhuǎn)錄本注釋為己知功能蛋白。|log2(foldchange)|2且qvalue0.001(極顯著差異)為篩選閾值,在出發(fā)菌株和酸耐受菌株中共獲得871個(gè)顯著差異表達(dá)的基因。相對于出發(fā)菌株,酸耐受菌株中有414個(gè)差異基因?yàn)樯险{(diào)表達(dá),457個(gè)為下調(diào)表達(dá)。生物學(xué)功能和信號通路富集分析表明,差異表達(dá)基因主要富集到代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、不同環(huán)境微生物代謝及氨基酸生物合成等相關(guān)信號通路中。極顯著差異表達(dá)基因中,與膜蛋白有關(guān)的基因33個(gè),與鞭毛有關(guān)的基因21個(gè),與耐藥基因有關(guān)的基因6個(gè),與毒性相關(guān)的基因22個(gè),與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因51個(gè),與金屬代謝和熱應(yīng)激相關(guān)的基因分別有16個(gè)和4個(gè)。以已有研究常用到的內(nèi)參基因(16srrna,reca,rpos,pvsa,pvua,andgapdh),針對副溶血性弧菌不同菌株(o3:k6-clinicalstrain-tdh+,atcc33846-tdh+,atcc33847-tdh+,atcc17802-trh+,andf13-environmentalstrain-tdh+),不同培養(yǎng)溫度條件下,利用genorm,normfinder,bestkeeper,anddeltact等不同計(jì)算方法的軟件對以上候選內(nèi)參基因進(jìn)行評價(jià)和排序,從而篩選得到適合具體實(shí)驗(yàn)條件的內(nèi)參基因。所得出的結(jié)論為reca基因?yàn)楸狙芯織l件中即針對不同菌株,不同溫度實(shí)驗(yàn)條件下最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因,其次為pvsa和pvua基因。以reca基因連同16srrna一并作為內(nèi)參基因,對隨機(jī)選取的4個(gè)上調(diào)基因,4個(gè)下調(diào)基因和2個(gè)無差異表達(dá)基因進(jìn)行定量pcr,結(jié)果發(fā)現(xiàn),qrt-pcr結(jié)果與測序結(jié)果一致,說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果可信。4.副溶血性弧菌比較蛋白組學(xué)分析。通過labelfree非標(biāo)記定量方法和對所得肽段進(jìn)行拼接,將拼接好的蛋白序列進(jìn)行庫比對注釋,然后將出發(fā)菌株o3:k6-c和酸耐受菌株o3:k6-e進(jìn)行差異表達(dá)分析。經(jīng)分析共獲得差異表達(dá)蛋白共1231個(gè),571個(gè)在兩組樣本中都表達(dá),另外305個(gè)蛋白序列僅在o3:k6-c樣本中檢測到表達(dá),355個(gè)僅在o3:k6-e樣本中檢測到表達(dá)。將得到的差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù)聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一起分析,結(jié)果得到注釋一致的序列共有546條。其中,轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)差異表達(dá)趨勢一致的基因共203個(gè)。其中ats、dps和ompt三個(gè)差異表達(dá)蛋白為酸耐受菌株較出發(fā)菌株顯著性高表達(dá),這與其酸耐受機(jī)制有關(guān)。另外t3ss表達(dá)在酸耐受菌株中直接不表達(dá),而其t2ss在酸耐受菌株中表達(dá)上調(diào)。從蛋白水平更好的解釋了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以及MSHA菌毛相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào),可能和生物膜形成能力下降和粘附性降低有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378

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本文編號：2401693