【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis),俗稱結(jié)核桿菌,是結(jié)核病的病原體。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,每年全世界新發(fā)生病例約900萬例,每年死亡300萬人,而這些死亡人口多集中在經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生、醫(yī)療環(huán)境相對落后的發(fā)展中國家。而中國是結(jié)核病高發(fā)國,僅次于印度。目前對結(jié)核病的診斷方法主要為細(xì)菌學(xué)檢查與結(jié)核菌素試驗,試驗周期長,因此,尋找和建立結(jié)核病快速診斷方法一直是人們所研究的重點。而結(jié)核分枝桿菌38KD蛋白因其在多種結(jié)核相關(guān)抗原中特異性和靈敏度均較高,更因其特有的強免疫原性成為結(jié)核分枝桿菌抗原的研究熱點。結(jié)核分支桿菌早期分泌性抗原靶(ESAT-6)具有較強的細(xì)胞免疫活性,能夠被有免疫活性的T細(xì)胞識別,生成大量的干擾素γ,從而產(chǎn)生保護(hù)性的細(xì)胞免疫,維持長期恒久的免疫記憶,因此有望成為人及動物結(jié)核病的特異性診斷試劑及疫苗開發(fā)侯選抗原。本研究利用本實驗室早期建立的實驗方法,對結(jié)核分枝桿菌38KD及ESAT-6蛋白進(jìn)行序列優(yōu)化合成、構(gòu)建真核表達(dá)載體并實現(xiàn)其在哺乳動物細(xì)胞中的大量分泌性表達(dá)。本研究分為四個部分,第一部分我們成功構(gòu)建了含結(jié)核分枝桿菌38KD蛋白基因的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,實現(xiàn)高效表達(dá)分泌性38KD蛋白。設(shè)計合成的結(jié)核分枝桿菌38KD基因被克隆到T載體,然后亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.0,經(jīng)酶切鑒定正確后,PEI轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入293T細(xì)胞。24h后換無血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天后收集細(xì)胞及上清,采用Western Blot方法檢測38KD蛋白的表達(dá)。酶切結(jié)果顯示,獲得正確的含38KD基因的重組表達(dá)載體;Western Blot結(jié)果顯示,載體導(dǎo)入293T細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)及上清中都能檢測到38KD蛋白表達(dá)。說明我們成功構(gòu)建了含結(jié)核分枝桿菌38KD蛋白基因的重組真核表達(dá)載體pCDNA3.0-38KD,該載體可在哺乳動物細(xì)胞293T中高效分泌性表達(dá)38KD蛋白。第二部分我們構(gòu)建了一個38KD蛋白與eGFP共表達(dá)的慢病毒載體pLV-38KD-IRES-eGFP 以及只表達(dá) 38KD 蛋白的 pLV-38KD,以研究 IRES-eGFP對38KD蛋白表達(dá)的影響。首先我們將攜帶有38KD基因的T載體及慢病毒載體用Mlu I和Nhe I雙酶切后構(gòu)建到慢病毒載體pLV-CMV-IRES-eGFP中得重到38KD蛋白與eGFP共表達(dá)載體pLV-38KD-IRES-eGFP;后者用Mlu I和Sal I雙酶切,去掉IRES-eGFP片段得到只表達(dá)38KD蛋白的載體pLV-38KD。將上述兩個表達(dá)載體用PEI轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入293T細(xì)胞,24h后換無血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天后收集細(xì)胞及上清,采用Western Blot方法檢測38KD蛋白的表達(dá)。酶切結(jié)果顯示,獲得正確的含38KD蛋白基因的慢病毒表達(dá)載體pLV-38KD-IRES-eGFP 及 pLV-38KD;Western Blot 結(jié)果顯示,載體導(dǎo)入 293T細(xì)胞后在細(xì)胞及上清中均能檢測到38KD蛋白的表達(dá),且去除IRES-eGFP的慢病毒表達(dá)載體,38KD蛋白的表達(dá)量明顯比38KD蛋白與eGFP共表達(dá)的慢病毒載體表達(dá)量高。說明我們成功構(gòu)建38KD蛋白與eGFP共表達(dá)以及只表達(dá)38KD蛋白的慢病毒表達(dá)載體,這兩種載體均可在哺乳動物細(xì)胞293T中高效分泌性表達(dá)38KD蛋白,IRES-eGFP對38KD蛋白的表達(dá)有明顯抑制作用。基于第二部分的研究,我們繼續(xù)探討IRES-eGFP對其它基因表達(dá)的影響。通過類似方法,我們構(gòu)建一個帶有結(jié)核分枝桿菌ESAT-6基因的共表達(dá)載體pLV-ESAT-6-IRES-eGFP及只表達(dá)ESAT-6基因的慢病毒載體pLV-ESAT-6。酶切結(jié)果顯示我們成功構(gòu)建了含結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白基因的慢病毒表達(dá)載體pLV-ESAT-6-IRES-eGFP 和 pLV-ESAT-6,Western Blot 結(jié)果顯示兩個載體均可在哺乳動物細(xì)胞293T中高效分泌性表達(dá)ESAT-6蛋白,IRES-eGFP對ESAT-6蛋白表達(dá)也有明顯抑制作用。第四部分,通過ELISA方法進(jìn)一步驗證38KD和ESAT-6蛋白的免疫原性。利用真核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)結(jié)核分枝桿菌38KD蛋白和ESAT-6蛋白,血清學(xué)鑒定結(jié)果顯示,兩種蛋白均能與結(jié)核病陽性血清發(fā)生免疫反應(yīng),ELISA反應(yīng)陽性率為71.43%和100%,說明表達(dá)出來的蛋白均具有免疫原性和較高的靈敏度。通過上述方法,我們成功構(gòu)建了含結(jié)核分枝桿菌38KD蛋白基因的真核表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞初步鑒定38KD蛋白可以在哺乳動物細(xì)胞中高效分泌性表達(dá);而我們構(gòu)建的含38KD蛋白基因的重組慢病毒表達(dá)載體也成功在HEK-293T細(xì)胞中表達(dá),且IRES-eGFP對38KD蛋白的表達(dá)有明顯抑制作用。通過類似方法構(gòu)建含結(jié)核分枝桿菌ESAT-6基因的慢病毒載體,實驗結(jié)果也表明IRES-eGFP對ESAT-6蛋白表達(dá)同樣有明顯抑制作用,其原因尚待進(jìn)一步研究。血清學(xué)結(jié)果顯示,本研究中表達(dá)的38KD蛋白和ESAT-6蛋白均具有免疫原性和較高的靈敏度。本研究獲得了高效表達(dá)重組結(jié)核分枝桿菌38KD和ESAT-6蛋白的真核表達(dá)載體,為后續(xù)建立穩(wěn)定高量38KD蛋白和ESAT-6蛋白生產(chǎn)平臺以及結(jié)核分枝桿菌診斷試劑盒的研發(fā)和疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R378.911

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2380640