【摘要】：結核分枝桿菌(M.tuberculosis),俗稱結核桿菌,是結核病的病原體。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,每年全世界新發(fā)生病例約900萬例,每年死亡300萬人,而這些死亡人口多集中在經(jīng)濟、衛(wèi)生、醫(yī)療環(huán)境相對落后的發(fā)展中國家。而中國是結核病高發(fā)國,僅次于印度。目前對結核病的診斷方法主要為細菌學檢查與結核菌素試驗,試驗周期長,因此,尋找和建立結核病快速診斷方法一直是人們所研究的重點。而結核分枝桿菌38KD蛋白因其在多種結核相關抗原中特異性和靈敏度均較高,更因其特有的強免疫原性成為結核分枝桿菌抗原的研究熱點。結核分支桿菌早期分泌性抗原靶(ESAT-6)具有較強的細胞免疫活性,能夠被有免疫活性的T細胞識別,生成大量的干擾素γ,從而產(chǎn)生保護性的細胞免疫,維持長期恒久的免疫記憶,因此有望成為人及動物結核病的特異性診斷試劑及疫苗開發(fā)侯選抗原。本研究利用本實驗室早期建立的實驗方法,對結核分枝桿菌38KD及ESAT-6蛋白進行序列優(yōu)化合成、構建真核表達載體并實現(xiàn)其在哺乳動物細胞中的大量分泌性表達。本研究分為四個部分,第一部分我們成功構建了含結核分枝桿菌38KD蛋白基因的真核表達載體并轉染HEK 293T細胞,實現(xiàn)高效表達分泌性38KD蛋白。設計合成的結核分枝桿菌38KD基因被克隆到T載體,然后亞克隆到真核表達載體pcDNA3.0,經(jīng)酶切鑒定正確后,PEI轉染法導入293T細胞。24h后換無血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天后收集細胞及上清,采用Western Blot方法檢測38KD蛋白的表達。酶切結果顯示,獲得正確的含38KD基因的重組表達載體;Western Blot結果顯示,載體導入293T細胞后在細胞內及上清中都能檢測到38KD蛋白表達。說明我們成功構建了含結核分枝桿菌38KD蛋白基因的重組真核表達載體pCDNA3.0-38KD,該載體可在哺乳動物細胞293T中高效分泌性表達38KD蛋白。第二部分我們構建了一個38KD蛋白與eGFP共表達的慢病毒載體pLV-38KD-IRES-eGFP 以及只表達 38KD 蛋白的 pLV-38KD,以研究 IRES-eGFP對38KD蛋白表達的影響。首先我們將攜帶有38KD基因的T載體及慢病毒載體用Mlu I和Nhe I雙酶切后構建到慢病毒載體pLV-CMV-IRES-eGFP中得重到38KD蛋白與eGFP共表達載體pLV-38KD-IRES-eGFP;后者用Mlu I和Sal I雙酶切,去掉IRES-eGFP片段得到只表達38KD蛋白的載體pLV-38KD。將上述兩個表達載體用PEI轉染法導入293T細胞,24h后換無血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天后收集細胞及上清,采用Western Blot方法檢測38KD蛋白的表達。酶切結果顯示,獲得正確的含38KD蛋白基因的慢病毒表達載體pLV-38KD-IRES-eGFP 及 pLV-38KD;Western Blot 結果顯示,載體導入 293T細胞后在細胞及上清中均能檢測到38KD蛋白的表達,且去除IRES-eGFP的慢病毒表達載體,38KD蛋白的表達量明顯比38KD蛋白與eGFP共表達的慢病毒載體表達量高。說明我們成功構建38KD蛋白與eGFP共表達以及只表達38KD蛋白的慢病毒表達載體,這兩種載體均可在哺乳動物細胞293T中高效分泌性表達38KD蛋白,IRES-eGFP對38KD蛋白的表達有明顯抑制作用。基于第二部分的研究,我們繼續(xù)探討IRES-eGFP對其它基因表達的影響。通過類似方法,我們構建一個帶有結核分枝桿菌ESAT-6基因的共表達載體pLV-ESAT-6-IRES-eGFP及只表達ESAT-6基因的慢病毒載體pLV-ESAT-6。酶切結果顯示我們成功構建了含結核分枝桿菌ESAT-6蛋白基因的慢病毒表達載體pLV-ESAT-6-IRES-eGFP 和 pLV-ESAT-6,Western Blot 結果顯示兩個載體均可在哺乳動物細胞293T中高效分泌性表達ESAT-6蛋白,IRES-eGFP對ESAT-6蛋白表達也有明顯抑制作用。第四部分,通過ELISA方法進一步驗證38KD和ESAT-6蛋白的免疫原性。利用真核表達系統(tǒng)高效表達結核分枝桿菌38KD蛋白和ESAT-6蛋白,血清學鑒定結果顯示,兩種蛋白均能與結核病陽性血清發(fā)生免疫反應,ELISA反應陽性率為71.43%和100%,說明表達出來的蛋白均具有免疫原性和較高的靈敏度。通過上述方法,我們成功構建了含結核分枝桿菌38KD蛋白基因的真核表達載體,通過轉染HEK-293T細胞初步鑒定38KD蛋白可以在哺乳動物細胞中高效分泌性表達;而我們構建的含38KD蛋白基因的重組慢病毒表達載體也成功在HEK-293T細胞中表達,且IRES-eGFP對38KD蛋白的表達有明顯抑制作用。通過類似方法構建含結核分枝桿菌ESAT-6基因的慢病毒載體,實驗結果也表明IRES-eGFP對ESAT-6蛋白表達同樣有明顯抑制作用,其原因尚待進一步研究。血清學結果顯示,本研究中表達的38KD蛋白和ESAT-6蛋白均具有免疫原性和較高的靈敏度。本研究獲得了高效表達重組結核分枝桿菌38KD和ESAT-6蛋白的真核表達載體,為后續(xù)建立穩(wěn)定高量38KD蛋白和ESAT-6蛋白生產(chǎn)平臺以及結核分枝桿菌診斷試劑盒的研發(fā)和疫苗的開發(fā)奠定基礎。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R378.911

【參考文獻】

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本文編號：2380640