【摘要】：丁型肝炎病毒是依賴于乙型肝炎病毒的缺陷性病毒,丁型肝炎病毒的感染通常伴隨更嚴(yán)重的肝損傷,給患者帶來了沉重的身體和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。丁型肝炎病毒是單鏈環(huán)狀RNA病毒,基因組約1.7kb。病毒的基因組只能編碼一個(gè)蛋白,在翻譯過程中由于宿主細(xì)胞的編輯作用會(huì)產(chǎn)生兩種形式的蛋白。除去在羧基端延伸增加的19個(gè)氨基酸外,其它部分的性質(zhì)完全一致,兩種形式的蛋白均可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異的免疫反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體被丁肝病毒感染時(shí),會(huì)持續(xù)產(chǎn)生特異性的不同類型的抗體,包括IgM和IgG。丁肝病毒抗原是用于血清學(xué)診斷的唯一的也是有效的候選抗原。通過現(xiàn)代基因技術(shù),可以大規(guī)模表達(dá)和純化具有生物學(xué)活性的重組丁肝抗原。配合逐步興起的高密度發(fā)酵技術(shù),獲得大量的活性蛋白,是將實(shí)驗(yàn)室和市場(chǎng)結(jié)合,科研轉(zhuǎn)化為應(yīng)用的重要步驟。本實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌偏好密碼子的基礎(chǔ)上,重新編碼了丁肝病毒抗原的基因序列,新的序列的GC含量為51.2%,不含有重復(fù)序列和不利于表達(dá)的順式元件,如SD相似序列等。將新的序列插入在pet43.1a表達(dá)載體,利用T7聚合酶強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄能力,在E.coli BL21 (DE3)菌株中可以大量表達(dá)重組蛋白,表達(dá)蛋白量可以達(dá)到總蛋白的23.6%。重組丁肝抗原以可溶性形式表達(dá),保留了生物學(xué)活性,同時(shí)省去了復(fù)性等的操作。應(yīng)用高密度發(fā)酵技術(shù)表達(dá)重組丁肝抗原,先后從接種量,發(fā)酵使用的碳源,氮源,反饋補(bǔ)料方式,誘導(dǎo)方式和誘導(dǎo)時(shí)間方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探索,最終確定了使用以碳源為控制因素的分批補(bǔ)料高密度發(fā)酵技術(shù)。在接種量為5%的條件下,利用葡萄糖作為控制碳源,控制菌體的比生長(zhǎng)速率為0.12h-1,使用乳糖誘導(dǎo)一個(gè)小時(shí)后,添加1mm IPTG作為誘導(dǎo)劑繼續(xù)誘導(dǎo)3個(gè)小時(shí),誘導(dǎo)時(shí)補(bǔ)料培養(yǎng)基中添加10g/L的酵母粉。經(jīng)過分批補(bǔ)料發(fā)酵后,菌體OD600吸光值可以達(dá)到62,誘導(dǎo)后重組蛋白的量約占細(xì)菌蛋白總量的20%,通過細(xì)胞干重和蛋白直接的關(guān)系,可以計(jì)算得到了0.5g/L的重組丁肝抗原,已經(jīng)達(dá)到了高密度細(xì)胞發(fā)酵的標(biāo)準(zhǔn)。表達(dá)的重組丁肝抗原可以使用固定化金屬離子螯合層析技術(shù)純化得到。首先利用超聲的方法將細(xì)菌破碎,在12000*g的條件下離心去除不溶的細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。利用重組丁肝抗原融合表達(dá)的6*his-tag可以與過渡態(tài)的金屬離子特異性結(jié)合的性質(zhì),進(jìn)行依賴鎳離子的固定化金屬螯合層析。在推薦使用的0.5mol/LNaCl時(shí),金屬離子和His-tag并不能結(jié)合,當(dāng)經(jīng)過1mol/LNaCl作用后,金屬離子可以結(jié)合重組丁肝抗原。通過改變緩沖液中NaCl的濃度,利用同一種方法,可以得到純度高于98%的重組丁肝抗原。高濃度的鹽對(duì)于重組丁肝抗原的純化是必須的,處理后的抗原與抗體結(jié)合的能力顯著增加。推測(cè)可能的原因是高鹽濃度改變了重組丁肝抗原的構(gòu)象,使得構(gòu)象接近天然構(gòu)象有利于和抗體的結(jié)合,同時(shí)暴露出his-tag與金屬離子結(jié)合。建立間接法測(cè)定血清中的IgG抗體：用重組丁肝抗原包被ELISA板,每孔約10ng。將待測(cè)血清稀釋10倍后,加入50微升在預(yù)包被了重組丁肝抗原的微孔中,在37℃條件下孵育30分鐘,使用PBST洗板5次后,加入HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體,37℃條件下孵育30分鐘,加入底物A液和B液各50微升,混勻后反應(yīng)10min,加入1.8mol/L的硫酸終止反應(yīng)。使用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)每孔的吸光值。建立了捕獲法測(cè)定血清中的IgM抗體：在預(yù)包被了鼠抗人IgM的ELISA板加入待檢血清50微升,混勻后37℃條件下反應(yīng)30分鐘。使用PBST洗板5次后加入100微升HRP標(biāo)記的重組丁肝抗原,37℃孵育30分鐘后使用PBST洗板5次,加入A液和B液反應(yīng)15分鐘后終止反應(yīng),檢測(cè)方法同間接法。使用1270份陰性血清確定了兩種方法的cut-off值,對(duì)于間接法,當(dāng)吸光值0.15判定為陰性,吸光值0.15時(shí)判定為陽性結(jié)果。捕獲法的判定結(jié)果與間接法相同。使用30份已知陽性標(biāo)本,90份非丁肝患者的血清檢驗(yàn)特異性和敏感性,兩種檢測(cè)方法的敏感性和特異性均達(dá)到了95%以上。本實(shí)驗(yàn)建立了依賴重組重組丁肝抗原的血清學(xué)檢測(cè)方法,具有良好的特異性和敏感性。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組丁肝病毒抗原的原核表達(dá)載體,在BL21(de3)菌株中可以高效表達(dá)重組蛋白。應(yīng)用高密度細(xì)胞發(fā)酵技術(shù),可以得到0.5g/L的重組丁肝抗原。使用親和層析,僅需改變鹽離子的濃度,可以獲得高活性高純度的重組抗原。重組丁肝抗原可以用于ELISA試劑盒的檢測(cè),依賴于重組丁肝抗原建立了間接法和捕獲法測(cè)定血清中的特異性抗體,符合臨床中對(duì)試劑盒的要求。本實(shí)驗(yàn)探索了利用高密度細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)在大腸桿菌中高效表達(dá)重組抗原的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)在當(dāng)前的醫(yī)藥行業(yè)和體外診斷等領(lǐng)域具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值,為其他蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
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本文編號(hào)：2379327