【摘要】：研究目的新生隱球菌是臨床最常見的侵襲性病原真菌之一,可附著于活體植入材料表面形成生物膜結(jié)構(gòu),從而顯著增強(qiáng)其對抗真菌藥物的耐藥性。本研究第一部分篩選鑒定了新生隱球菌生物膜態(tài)的3個(gè)外分泌差異蛋白,并初步論證其對隱球菌生物膜形成及毒力的功能影響。第二部分,我們將隱球菌金屬蛋白酶Cn Mpr1在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)后發(fā)現(xiàn),和野生株比,Cn MPR1表達(dá)株ScCn MPR1獲得了穿越體外血腦屏障模型的能力,說明Cn Mpr1可以獨(dú)立于透明質(zhì)酸-CD44等其他途徑單獨(dú)在隱球菌穿越血腦屏障中其重要作用。在本部分研究中,我們擬利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞潛在的與Cn Mpr1相互作用的受體蛋白。在第三部分的研究中,我們合成了不同直徑的銀包鈀納米片以檢測它們對各種主要侵襲性致病真菌的抑制作用。研究方法第一部分利用同源重組原理和基因槍技術(shù)構(gòu)建各差異蛋白的基因缺失株,結(jié)合生物膜表型檢測及細(xì)胞、動物實(shí)驗(yàn)探索其對隱球菌生物膜形成與毒力的影響。第二部分我們利用免疫磁珠法提取h CMEC/D3細(xì)胞表面蛋白,通過與ScCn MPR1(野生株作對照)共同孵育后提取蛋白進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜檢測與分析。第三部分我們首先利用微量稀釋法測試不同直徑的銀包鈀納米片對各種深部致病真菌的抗真菌活性。隨后我們就銀包鈀納米片對新生隱球菌的抑菌作用及其作用機(jī)制進(jìn)行探究。結(jié)果第一部分中,體外生物膜檢測發(fā)現(xiàn),較之標(biāo)準(zhǔn)株,vid△表現(xiàn)出顯著的生物膜形成能力的下降,同時(shí)其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存率及對小鼠吸入感染模型的毒力顯著減弱。第二部分蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,我們共發(fā)現(xiàn)79個(gè)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白與ScCn MPR1的結(jié)合能力增強(qiáng)。第三部分我們成功合成了不同直徑的銀包鈀納米片,發(fā)現(xiàn)其對主要深部致病真菌特別是新生隱球菌具有明顯的抑制作用。銀包鈀納米片的抗真菌作用明顯優(yōu)于氟康唑,且接近兩性霉素B,而其溶血作用遠(yuǎn)小于兩性霉素B。銀包鈀納米片和兩性霉素B具有一定的聯(lián)合殺菌作用。新生隱球菌和銀包鈀納米片相互作用后,細(xì)胞膜的完整性遭到破壞,通透性明顯增加。結(jié)論一、我們的研究首次發(fā)現(xiàn)外分泌蛋白Vid對新生隱球菌的生物膜形成以及致病感染具有重要的調(diào)節(jié)功能。二、與ScCn MPR1相互作用的宿主蛋白質(zhì)中,將近三分之一的蛋白質(zhì)與細(xì)胞骨架和膜重排相關(guān);分別有16%的蛋白質(zhì)與代謝過程以及蛋白質(zhì)合成有關(guān);以及其他一些與細(xì)胞運(yùn)輸、免疫、蛋白質(zhì)折疊和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)。我們推測這些蛋白在隱球菌穿越血腦屏障過程以及與Mpr1的相互作用中起著重要作用。三、我們的研究首次發(fā)現(xiàn)銀包鈀納米片具有抗新生隱球菌作用,其作用機(jī)制可能與破壞細(xì)胞膜通透性,打亂細(xì)胞內(nèi)蛋白合成與能量代謝有關(guān)。
[Abstract]:Objective Cryptococcus neoformans (Cryptococcus neoformans) is one of the most common invasive fungi in clinic. In the first part of this study, three exocrine differentially secreted proteins of Cryptococcus neoformans biofilm state were identified, and their effects on biofilm formation and virulence of Cryptococcus neoformans were preliminarily demonstrated. In the second part, we expressed Cryptococcus metalloproteinase Cn Mpr1 in Saccharomyces cerevisiae cells and found that compared with the wild strain, ScCn MPR1 obtained the ability to cross the blood-brain barrier model in vitro. The results suggest that Cn Mpr1 can play an important role in Cryptococcus Blood-brain Barrier independently of other pathways such as hyaluronic acid-CD44. In this part of the study, we intend to use proteomics techniques to analyze the potential receptor proteins interacting with Cn Mpr1 in brain microvascular endothelial cells. In the third part, we synthesized silver coated palladium nanoparticles with different diameters to detect their inhibitory effects on various major invasive fungi. Methods in the first part, the homologous recombination principle and gene gun technique were used to construct the gene deletion strains of different proteins. Combined with biofilm phenotypic detection and cell, animal experiments were conducted to explore its effect on the biofilm formation and virulence of Cryptococcus. In the second part, the surface proteins of h CMEC/D3 cells were extracted by immunomagnetic bead method. The extracted proteins were detected and analyzed by MALDI-TOF-MS mass spectrometry after incubation with ScCn MPR1 (wild strain as control). In the third part, the antifungal activity of silver coated palladium nanoparticles with different diameters against various deep pathogenic fungi was tested by microdilution method. Then we studied the bacteriostatic effect and mechanism of silver-coated palladium nanoparticles on Cryptococcus neoformans. Results in the first part, in vitro biofilm assay showed that vid showed a significant decrease in biofilm formation, and its survival rate in macrophages and its toxicity to mouse model of inhalation infection were significantly decreased compared with the standard strain. In the second part of proteomics, we found that 79 brain microvascular endothelial cell proteins had enhanced binding ability to ScCn MPR1. In the third part, we successfully synthesized silver coated palladium nanoparticles with different diameters, and found that they had obvious inhibitory effects on the main deep pathogenic fungi, especially Cryptococcus neoformans (Cryptococcus neoformans). The antifungal effect of silver coated palladium nanoparticles was better than fluconazole and was close to amphotericin B, but its hemolytic effect was much less than amphotericin B. Silver-coated palladium nanoparticles and amphotericin B have a combined bactericidal effect. After interaction between Cryptococcus neoformans and silver coated palladium nanoparticles, the integrity of cell membrane was destroyed and the permeability increased significantly. Conclusion: for the first time, we found that exocrine protein Vid plays an important role in regulating biofilm formation and pathogenic infection of Cryptococcus neoformans. Secondly, nearly 1/3 of the host proteins interacting with ScCn MPR1 were related to cytoskeleton and membrane rearrangement, 16% of proteins were related to metabolic process and protein synthesis, respectively. And other proteins related to cell transport, immunity, protein folding, and cell signal transduction. We speculate that these proteins play an important role in Cryptococcus Blood-Brain Barrier and interaction with Mpr1. Third, we first found that silver coated palladium nanoparticles have anti-Cryptococcus neoformans action mechanism may be related to the destruction of cell membrane permeability, disrupting intracellular protein synthesis and energy metabolism.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R379.5

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本文編號：2371688