【摘要】：登革病毒(Dengue virus,DENV)是登革熱、登革出血熱和登革休克綜合征的病原體,有四種血清型(DENV1-4),其中DENV-2毒力最強(qiáng)。近年來(lái)DENV感染呈擴(kuò)大蔓延之勢(shì),發(fā)病率不斷升高,DENV感染已經(jīng)成為熱帶、亞熱帶地區(qū)嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。DENV在分類上屬于黃病毒科的黃病毒屬,是單股正鏈RNA病毒。關(guān)于它的復(fù)制機(jī)理,尤其是RNA復(fù)制的分子機(jī)制尚不清楚。最近一些研究顯示,除了病毒蛋白外,宿主蛋白在病毒翻譯和復(fù)制調(diào)控中起著重要作用。迄今為止,僅有少數(shù)參與DENV復(fù)制周期的宿主蛋白被鑒定出來(lái),其中RNA結(jié)合蛋白(RBP)在病毒RNA代謝、修飾以及終止翻譯和啟始RNA合成中起到重要作用。DENV基因組非編碼區(qū)5'UTR和3'UTR是宿主RBPs的主要結(jié)合區(qū)域,在病毒的復(fù)制和翻譯中起著重要調(diào)控作用。本研究以DENV-2為研究對(duì)象,利用RNA親和捕捉法聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)分別對(duì)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)組裝的DENV-2 5'-3'UTR-蛋白復(fù)合體進(jìn)行分離鑒定,并進(jìn)一步對(duì)其中的部分候選蛋白在DENV-2基因組復(fù)制過(guò)程中的作用進(jìn)行了研究,為進(jìn)一步理解DENV-2基因組復(fù)制機(jī)制提供了有益的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí),本研究還建立了一步法分離細(xì)胞內(nèi)RNA-蛋白復(fù)合物的技術(shù)對(duì)于分離和闡明宿主RBP在單股正鏈RNA病毒中的調(diào)控作用提供了重要的技術(shù)平臺(tái)�！局饕獙�(shí)驗(yàn)方法和研究結(jié)果】1.分離與鑒定DENV-2 RNA 5'-3'UTR結(jié)合的宿主蛋白首先將DENV-2 5'UTR和3'UTR c DNA克隆到p CI-neo載體中構(gòu)建p CI-5'-3'UTR質(zhì)粒;單酶切后以含有T7啟動(dòng)子的5'-3'UTR為底物體外轉(zhuǎn)錄生成5'-3'UTR RNA;然后將帶生物素標(biāo)記的寡核苷酸直接添加到5'-3'UTR RNA的3'末端,生成5'-3'UTR-bio RNA;5'-3'UTR-bio RNA與胞漿蛋白孵育后,通過(guò)鏈親和素偶聯(lián)的磁珠直接分離胞漿中與5'-3'UTR-bio RNA結(jié)合的宿主蛋白。與單獨(dú)磁珠組相比,5'-3'UTR-bio RNA組的SDS-PAGE結(jié)果顯示共有9個(gè)特異的差異條帶;對(duì)9個(gè)膠條進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果顯示共有78個(gè)潛在的與5'-3'UTR RNA結(jié)合的宿主蛋白;選擇PB小體組分LSm1蛋白和DEx D/H蛋白家族成員DDX21,進(jìn)一步分析了它們?cè)贒ENV-2復(fù)制過(guò)程中的作用。為了探究LSm1蛋白在DENV-2復(fù)制過(guò)程中的作用機(jī)制,首先通過(guò)RT-q PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了DENV-2感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)LSm1 m RNA水平,結(jié)果顯示:隨著病毒感染時(shí)間延長(zhǎng),DENV-2 RNA和LSm1 m RNA的水平均逐漸升高。隨后將針對(duì)LSm1靶基因的si RNA轉(zhuǎn)染到Hep G2細(xì)胞中,使細(xì)胞中LSm1低表達(dá),觀察對(duì)DENV-2 RNA復(fù)制的影響,RT-q PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:LSm1低表達(dá)的細(xì)胞中DENV-2 RNA水平降低。收獲DENV-2感染低表達(dá)LSm1細(xì)胞的培養(yǎng)上清,通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定培養(yǎng)上清中子代DENV-2感染細(xì)胞的比例,以此明確細(xì)胞中低表達(dá)LSm1蛋白對(duì)子代DENV-2產(chǎn)出的影響,結(jié)果顯示:低表達(dá)LSm1蛋白的細(xì)胞中子代DENV-2顆粒產(chǎn)生減少。為了分析研究DENV-2 RNA與LSm1的相互作用,利用激光共聚焦顯微鏡觀察了LSm1蛋白在DENV-2感染細(xì)胞中的分布,結(jié)果顯示:LSm1蛋白與ds RNA在胞漿中的核周圍存在共定位。RNA免疫沉淀試驗(yàn)(RIP)的結(jié)果進(jìn)一步表明LSm1蛋白直接與DENV-2 RNA的3'UTR結(jié)合。以上結(jié)果提示,在DENV-2感染的細(xì)胞中,LSm1蛋白表達(dá)升高,并且被募集到DENV-2復(fù)制的場(chǎng)所,與病毒3'UTR RNA結(jié)合,從而增強(qiáng)DENV-2的RNA復(fù)制。為了研究DDX21蛋白在DENV-2復(fù)制中的作用機(jī)制,首先通過(guò)Western blotting檢測(cè)了DENV感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)DDX21的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果表明:DDX21蛋白水平在病毒感染后12 h和24 h顯著下降,在感染后36 h恢復(fù)并高于正常水平。然后觀察DDX21蛋白在DENV-2感染前后的細(xì)胞內(nèi)分布情況,分別收獲DENV感染和未感染細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白,Western blotting檢測(cè)DDX21的蛋白水平,結(jié)果顯示:DENV-2感染的細(xì)胞中,細(xì)胞核中的DDX21蛋白水平顯著下降,而細(xì)胞質(zhì)中的DDX21蛋白水平略微上升,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)DDX21蛋白在DENV-2感染和未感染細(xì)胞中的分布,結(jié)果顯示:在DENV-2感染的細(xì)胞中,DDX21在細(xì)胞核中的染色強(qiáng)度減弱,而DDX21在細(xì)胞質(zhì)中的染色并沒(méi)有顯著變化。隨后我們分別在細(xì)胞低表達(dá)和過(guò)表達(dá)DDX21,然后感染DENV-2并通過(guò)RT-q PCR檢測(cè)DENV-2 RNA復(fù)制的水平,結(jié)果顯示:DDX21低表達(dá)的細(xì)胞中DENV-2RNA表達(dá)增高,而其在DDX21過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中明顯降低。為了明確DDX21蛋白在抑制DENV-2復(fù)制過(guò)程中的機(jī)制,我們又通過(guò)雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了DENV-2感染細(xì)胞中IFN-β和IFN報(bào)告基因的活性,結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)DDX21蛋白的細(xì)胞受到DENV-2感染后,IFN-β和干擾素激活反應(yīng)元件(ISRE)的反應(yīng)水平顯著升高。為了進(jìn)一步探索DENV-2如何拮抗DDX21的抑制功能,我們將DDX21與DENV-2絲氨酸蛋白酶復(fù)合體NS2b/3的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,Western blotting檢測(cè)DDX21蛋白水平,結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染DENV-2 NS2b/3的細(xì)胞中DDX21的水平明顯降低。隨后在培養(yǎng)液中加入蛋白酶抑制MG132后,Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,與NS2b/3共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中DDX21水平無(wú)明顯變化。以上研究結(jié)果提示,在DENV-2感染的細(xì)胞中,定位于細(xì)胞核的DDX21蛋白被募集到細(xì)胞質(zhì)中,參與激活I(lǐng)FN等固有免疫應(yīng)答,從而抑制病毒復(fù)制;隨后DENV-2 RNA翻譯產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶復(fù)合物NS2b/3將細(xì)胞質(zhì)中的DDX21降解,從而拮抗了DDX21的抗病毒作用。RIP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DDX21蛋白在上述過(guò)程中與DENV-2 RNA的3'UTR有相互作用。2.分離細(xì)胞內(nèi)組裝的DENV-2 5'-3'UTR-RBP復(fù)合物方法的建立鑒于體外合成RNA組裝的RNP可能與細(xì)胞內(nèi)自然狀態(tài)下形成的不同,為了克服體外分離RBP方法存在的局限,本研究探索建立了分離細(xì)胞內(nèi)組裝DENV-25'-3'UTR RNA與宿主蛋白復(fù)合物的新方法。首先我們將DENV-2 5'-3'UTR c DNA和生物素樣S1序列克隆到RNA轉(zhuǎn)錄載體p HH21中,構(gòu)建p HH21-5'-3'U-S1質(zhì)粒。然后將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成5'-3'UTR-S1 RNA,與宿主蛋白結(jié)合細(xì)胞內(nèi)組裝RNA-RBP復(fù)合物。細(xì)胞經(jīng)365 nm UV交聯(lián)后,通過(guò)鏈親和素包被的磁珠RNA親和捕捉法分離細(xì)胞內(nèi)組裝的5'-3'UTR-S1-RBP復(fù)合物。SDS-PAGE的結(jié)果顯示有3個(gè)特異膠條,質(zhì)譜分析共有32個(gè)可能與5'-3'UTR結(jié)合的宿主蛋白。為進(jìn)一步分析IGF2BP m RNA小體的組分RPS8蛋白在DENV-2復(fù)制中的作用,我們首先利用RT-q PCR法檢測(cè)了DENV-2感染過(guò)表達(dá)RPS8的細(xì)胞中DENV-2 RNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示:RPS8過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中,DENV-2 RNA水平明顯升高。同時(shí)收獲了DENV-2感染過(guò)表達(dá)RPS8蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清,培養(yǎng)上清倍比稀釋后感染BHK-21細(xì)胞后染色,空斑形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:DENV-2感染過(guò)表達(dá)PRS8的細(xì)胞上清中產(chǎn)出更多子代病毒。然后利用RIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了DENV-2 RNA與RPS8的結(jié)合情況,結(jié)果顯示:RPS8抗體的RIP產(chǎn)物中可以擴(kuò)增5'UTR和3'UTR。同時(shí),激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果表明RPS8與ds RNA在胞漿中存在共定位。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RPS8與DENV-2 RNA的5'UTR和3'UTR均有結(jié)合,它可能作為病毒復(fù)制復(fù)合物的一部分促進(jìn)DENV-2在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。【結(jié)論】本研究建立的兩種RNA親和捕捉方法均能成功篩選到與DENV-2 5'-3'UTR相互作用的宿主蛋白。我們發(fā)現(xiàn)LSm1和RPS8等宿主蛋白均可促進(jìn)DENV-2復(fù)制,LSm1通過(guò)3'UTR與DENV-2 RNA結(jié)合,RPS8蛋白與DENV-2 RNA 5'UTR和3'UTR均有相互作用。DDX21在感染早期抑制DENV-2的復(fù)制,而它可被DENV NS2B/3蛋白酶復(fù)合體降解從而有利于病毒的復(fù)制。本研究為進(jìn)一步理解DENV-2基因組復(fù)制機(jī)制提供了有益的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí),建立的一步法分離細(xì)胞內(nèi)RNA-蛋白復(fù)合物的技術(shù)對(duì)于分離在單股正鏈RNA病毒中起到調(diào)控作用的宿主RBP提供了新方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2330079