【摘要】：登革病毒(Dengue virus,DENV)是登革熱、登革出血熱和登革休克綜合征的病原體,有四種血清型(DENV1-4),其中DENV-2毒力最強。近年來DENV感染呈擴大蔓延之勢,發(fā)病率不斷升高,DENV感染已經(jīng)成為熱帶、亞熱帶地區(qū)嚴重的社會公共衛(wèi)生問題之一。DENV在分類上屬于黃病毒科的黃病毒屬,是單股正鏈RNA病毒。關(guān)于它的復制機理,尤其是RNA復制的分子機制尚不清楚。最近一些研究顯示,除了病毒蛋白外,宿主蛋白在病毒翻譯和復制調(diào)控中起著重要作用。迄今為止,僅有少數(shù)參與DENV復制周期的宿主蛋白被鑒定出來,其中RNA結(jié)合蛋白(RBP)在病毒RNA代謝、修飾以及終止翻譯和啟始RNA合成中起到重要作用。DENV基因組非編碼區(qū)5'UTR和3'UTR是宿主RBPs的主要結(jié)合區(qū)域,在病毒的復制和翻譯中起著重要調(diào)控作用。本研究以DENV-2為研究對象,利用RNA親和捕捉法聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)分別對細胞外和細胞內(nèi)組裝的DENV-2 5'-3'UTR-蛋白復合體進行分離鑒定,并進一步對其中的部分候選蛋白在DENV-2基因組復制過程中的作用進行了研究,為進一步理解DENV-2基因組復制機制提供了有益的理論基礎和實驗依據(jù)。同時,本研究還建立了一步法分離細胞內(nèi)RNA-蛋白復合物的技術(shù)對于分離和闡明宿主RBP在單股正鏈RNA病毒中的調(diào)控作用提供了重要的技術(shù)平臺�！局饕獙嶒灧椒ê脱芯拷Y(jié)果】1.分離與鑒定DENV-2 RNA 5'-3'UTR結(jié)合的宿主蛋白首先將DENV-2 5'UTR和3'UTR c DNA克隆到p CI-neo載體中構(gòu)建p CI-5'-3'UTR質(zhì)粒;單酶切后以含有T7啟動子的5'-3'UTR為底物體外轉(zhuǎn)錄生成5'-3'UTR RNA;然后將帶生物素標記的寡核苷酸直接添加到5'-3'UTR RNA的3'末端,生成5'-3'UTR-bio RNA;5'-3'UTR-bio RNA與胞漿蛋白孵育后,通過鏈親和素偶聯(lián)的磁珠直接分離胞漿中與5'-3'UTR-bio RNA結(jié)合的宿主蛋白。與單獨磁珠組相比,5'-3'UTR-bio RNA組的SDS-PAGE結(jié)果顯示共有9個特異的差異條帶;對9個膠條進行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果顯示共有78個潛在的與5'-3'UTR RNA結(jié)合的宿主蛋白;選擇PB小體組分LSm1蛋白和DEx D/H蛋白家族成員DDX21,進一步分析了它們在DENV-2復制過程中的作用。為了探究LSm1蛋白在DENV-2復制過程中的作用機制,首先通過RT-q PCR實驗檢測了DENV-2感染細胞不同時間點LSm1 m RNA水平,結(jié)果顯示:隨著病毒感染時間延長,DENV-2 RNA和LSm1 m RNA的水平均逐漸升高。隨后將針對LSm1靶基因的si RNA轉(zhuǎn)染到Hep G2細胞中,使細胞中LSm1低表達,觀察對DENV-2 RNA復制的影響,RT-q PCR實驗結(jié)果顯示:LSm1低表達的細胞中DENV-2 RNA水平降低。收獲DENV-2感染低表達LSm1細胞的培養(yǎng)上清,通過流式細胞儀測定培養(yǎng)上清中子代DENV-2感染細胞的比例,以此明確細胞中低表達LSm1蛋白對子代DENV-2產(chǎn)出的影響,結(jié)果顯示:低表達LSm1蛋白的細胞中子代DENV-2顆粒產(chǎn)生減少。為了分析研究DENV-2 RNA與LSm1的相互作用,利用激光共聚焦顯微鏡觀察了LSm1蛋白在DENV-2感染細胞中的分布,結(jié)果顯示:LSm1蛋白與ds RNA在胞漿中的核周圍存在共定位。RNA免疫沉淀試驗(RIP)的結(jié)果進一步表明LSm1蛋白直接與DENV-2 RNA的3'UTR結(jié)合。以上結(jié)果提示,在DENV-2感染的細胞中,LSm1蛋白表達升高,并且被募集到DENV-2復制的場所,與病毒3'UTR RNA結(jié)合,從而增強DENV-2的RNA復制。為了研究DDX21蛋白在DENV-2復制中的作用機制,首先通過Western blotting檢測了DENV感染細胞不同時間點DDX21的蛋白表達水平,結(jié)果表明:DDX21蛋白水平在病毒感染后12 h和24 h顯著下降,在感染后36 h恢復并高于正常水平。然后觀察DDX21蛋白在DENV-2感染前后的細胞內(nèi)分布情況,分別收獲DENV感染和未感染細胞細胞核和細胞質(zhì)蛋白,Western blotting檢測DDX21的蛋白水平,結(jié)果顯示:DENV-2感染的細胞中,細胞核中的DDX21蛋白水平顯著下降,而細胞質(zhì)中的DDX21蛋白水平略微上升,但無統(tǒng)計學意義。同時用激光共聚焦顯微鏡檢測DDX21蛋白在DENV-2感染和未感染細胞中的分布,結(jié)果顯示:在DENV-2感染的細胞中,DDX21在細胞核中的染色強度減弱,而DDX21在細胞質(zhì)中的染色并沒有顯著變化。隨后我們分別在細胞低表達和過表達DDX21,然后感染DENV-2并通過RT-q PCR檢測DENV-2 RNA復制的水平,結(jié)果顯示:DDX21低表達的細胞中DENV-2RNA表達增高,而其在DDX21過表達的細胞中明顯降低。為了明確DDX21蛋白在抑制DENV-2復制過程中的機制,我們又通過雙熒光素酶活性實驗檢測了DENV-2感染細胞中IFN-β和IFN報告基因的活性,結(jié)果顯示:過表達DDX21蛋白的細胞受到DENV-2感染后,IFN-β和干擾素激活反應元件(ISRE)的反應水平顯著升高。為了進一步探索DENV-2如何拮抗DDX21的抑制功能,我們將DDX21與DENV-2絲氨酸蛋白酶復合體NS2b/3的真核表達載體共轉(zhuǎn)染細胞后,Western blotting檢測DDX21蛋白水平,結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染DENV-2 NS2b/3的細胞中DDX21的水平明顯降低。隨后在培養(yǎng)液中加入蛋白酶抑制MG132后,Western blotting檢測結(jié)果顯示,與NS2b/3共轉(zhuǎn)染的細胞中DDX21水平無明顯變化。以上研究結(jié)果提示,在DENV-2感染的細胞中,定位于細胞核的DDX21蛋白被募集到細胞質(zhì)中,參與激活I(lǐng)FN等固有免疫應答,從而抑制病毒復制;隨后DENV-2 RNA翻譯產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶復合物NS2b/3將細胞質(zhì)中的DDX21降解,從而拮抗了DDX21的抗病毒作用。RIP的實驗結(jié)果表明DDX21蛋白在上述過程中與DENV-2 RNA的3'UTR有相互作用。2.分離細胞內(nèi)組裝的DENV-2 5'-3'UTR-RBP復合物方法的建立鑒于體外合成RNA組裝的RNP可能與細胞內(nèi)自然狀態(tài)下形成的不同,為了克服體外分離RBP方法存在的局限,本研究探索建立了分離細胞內(nèi)組裝DENV-25'-3'UTR RNA與宿主蛋白復合物的新方法。首先我們將DENV-2 5'-3'UTR c DNA和生物素樣S1序列克隆到RNA轉(zhuǎn)錄載體p HH21中,構(gòu)建p HH21-5'-3'U-S1質(zhì)粒。然后將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后,在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成5'-3'UTR-S1 RNA,與宿主蛋白結(jié)合細胞內(nèi)組裝RNA-RBP復合物。細胞經(jīng)365 nm UV交聯(lián)后,通過鏈親和素包被的磁珠RNA親和捕捉法分離細胞內(nèi)組裝的5'-3'UTR-S1-RBP復合物。SDS-PAGE的結(jié)果顯示有3個特異膠條,質(zhì)譜分析共有32個可能與5'-3'UTR結(jié)合的宿主蛋白。為進一步分析IGF2BP m RNA小體的組分RPS8蛋白在DENV-2復制中的作用,我們首先利用RT-q PCR法檢測了DENV-2感染過表達RPS8的細胞中DENV-2 RNA表達水平,結(jié)果顯示:RPS8過表達的細胞中,DENV-2 RNA水平明顯升高。同時收獲了DENV-2感染過表達RPS8蛋白的細胞培養(yǎng)上清,培養(yǎng)上清倍比稀釋后感染BHK-21細胞后染色,空斑形成實驗結(jié)果顯示:DENV-2感染過表達PRS8的細胞上清中產(chǎn)出更多子代病毒。然后利用RIP實驗檢測了DENV-2 RNA與RPS8的結(jié)合情況,結(jié)果顯示:RPS8抗體的RIP產(chǎn)物中可以擴增5'UTR和3'UTR。同時,激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果表明RPS8與ds RNA在胞漿中存在共定位。上述實驗結(jié)果表明,RPS8與DENV-2 RNA的5'UTR和3'UTR均有結(jié)合,它可能作為病毒復制復合物的一部分促進DENV-2在細胞內(nèi)的復制�！窘Y(jié)論】本研究建立的兩種RNA親和捕捉方法均能成功篩選到與DENV-2 5'-3'UTR相互作用的宿主蛋白。我們發(fā)現(xiàn)LSm1和RPS8等宿主蛋白均可促進DENV-2復制,LSm1通過3'UTR與DENV-2 RNA結(jié)合,RPS8蛋白與DENV-2 RNA 5'UTR和3'UTR均有相互作用。DDX21在感染早期抑制DENV-2的復制,而它可被DENV NS2B/3蛋白酶復合體降解從而有利于病毒的復制。本研究為進一步理解DENV-2基因組復制機制提供了有益的理論基礎和實驗依據(jù)。同時,建立的一步法分離細胞內(nèi)RNA-蛋白復合物的技術(shù)對于分離在單股正鏈RNA病毒中起到調(diào)控作用的宿主RBP提供了新方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373

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