【摘要】：第一部分EphB2在B細(xì)胞上表達(dá)及其作用的初步研究背景：EphB2是受體型酪氨酸激酶Eph家族成員,主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上,可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移及內(nèi)皮細(xì)胞簇集。近年研究發(fā)現(xiàn),EphB2在T細(xì)胞和單核細(xì)胞上也有表達(dá),并且其前向信號可促進(jìn)T細(xì)胞遷移和單核細(xì)胞活化。然而,EphB2在B細(xì)胞上的表達(dá)及作用至今尚無明確報(bào)道。方法：取健康志愿者靜脈血,分選出B淋巴細(xì)胞。分別利用LPS、anti-IgM和IL-4刺激幼稚B細(xì)胞活化,以western blot檢測EphB2及其配體ephrinB1/B2蛋白表達(dá)情況。同時(shí),通過轉(zhuǎn)染EphB2 siRNA以抑制EphB2表達(dá),并設(shè)立陰性對照siRNA(NC)轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染對照組,檢測其對B細(xì)胞增殖、分泌細(xì)胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗體水平的影響。結(jié)果：EphB2及其特異性配體ephrinB1和ephrinB2在人外周血幼稚B細(xì)胞上均有表達(dá),且體外刺激B細(xì)胞活化后,EphB2表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05),而ephrinB1和ephrinB2表達(dá)均無明顯變化。同時(shí),轉(zhuǎn)染siRNA并檢測B細(xì)胞活化指標(biāo),結(jié)果顯示,與NC轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染對照組相比,EphB2 siRNA轉(zhuǎn)染組B細(xì)胞增殖(P0.05)、B細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α (P0.01)及IgG水平(P0.05)均顯著下降,然而各組之間IgM水平無明顯差異。結(jié)論：EphB2及其配體ephrinB1/B2在人B細(xì)胞上有表達(dá),且EphB2在B細(xì)胞活化中起到重要的促進(jìn)作用。第二部分調(diào)控B細(xì)胞EphB2表達(dá)的microRNA的篩選和鑒定背景：microRNA是一種內(nèi)源性的、長度約為20-24個(gè)核苷酸的小RNA,通過與mRNA特異性結(jié)合使其降解或抑制其翻譯為蛋白質(zhì),并因其穩(wěn)定性、保守性及靶向結(jié)合的特異性,成為疾病分子靶向治療方面的研究熱點(diǎn)。有研究顯示,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中,EphB2表達(dá)可受到多種microRNA的調(diào)控。因此,篩選出具有特異性調(diào)控B細(xì)胞EphB2表達(dá)的microRNA對進(jìn)一步研究EphB2在B細(xì)胞中的作用機(jī)制有重要價(jià)值。方法：利用miRWalk數(shù)據(jù)庫并綜合參考5種生物信息學(xué)分析結(jié)果,預(yù)測可調(diào)控人EphB2表達(dá)的microRNAs,并利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測上述microRNAs在B細(xì)胞中的表達(dá)情況。之后,構(gòu)建含有EphB2 3'UTR結(jié)合位點(diǎn)的熒光霉素報(bào)告基因載體質(zhì)粒,并與miR-185模擬物或模擬物NC共轉(zhuǎn)染入工具細(xì)胞293T內(nèi),檢測各組細(xì)胞的熒光值,以驗(yàn)證miR-185是否可與EphB2 mRNA特異性結(jié)合并影響EphB2表達(dá)。另外,通過轉(zhuǎn)染miR-185模擬物和抑制劑進(jìn)入B細(xì)胞,并western檢測B細(xì)胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2 (+) B細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度,以進(jìn)一步驗(yàn)證miR-185是否可影響B(tài)細(xì)胞上EphB2的表達(dá);同時(shí),檢測B細(xì)胞增殖、分泌細(xì)胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗體水平,以探究miR-185對B細(xì)胞活化的影響。結(jié)果：miRWalk數(shù)據(jù)庫預(yù)測出miRNA-185、miRNA-661、miRNA-593、 miRNA-211、miRNA-515和miRNA-204這6種microRNA可調(diào)控人EphB2表達(dá)。上述6種microRNA在人外周血幼稚B細(xì)胞中均有表達(dá),然而只有miRNA-185, miRNA-515和miRNA-204在活化的B細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)(P0.05),且與miRNA-515和miRNA-204相比,miRNA-185下調(diào)更為明顯(P0.05)。熒光霉素報(bào)告基因結(jié)果顯示,含EphB2 3'UTR野生型結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因與miRNA-185模擬物共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光測值下降41%(P0.01)。進(jìn)一步,我們分別轉(zhuǎn)染miR-185模擬物和抑制劑進(jìn)入B細(xì)胞,檢測到與NC組和非轉(zhuǎn)染對照組相比,miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組中western檢測B細(xì)胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2 (+) B細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度均明顯下調(diào)(P0.05), miR-185抑制劑轉(zhuǎn)染組中western檢測B細(xì)胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2 (+) B細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度均明顯上調(diào)(P0.05)：同時(shí),我們檢測各組B細(xì)胞活化指標(biāo),結(jié)果顯示,miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細(xì)胞增殖(P0.05)、B細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α (P0.01)及IgG水平(P0.05)均顯著下降,miR-185抑制劑轉(zhuǎn)染組B細(xì)胞增殖(P0.05)、B細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α (P0.01)及IgG水平(P0.05)均顯著上升。結(jié)論：miR-185可特異性抑制B細(xì)胞上EphB2表達(dá),從而阻礙B細(xì)胞活化。第三部分EphB2調(diào)控B細(xì)胞活化的分子機(jī)制背景：細(xì)胞活化的核心轉(zhuǎn)錄因子為NF-κB,其亞基p65是B細(xì)胞活化中的重要信號分子。在神經(jīng)細(xì)胞中,Src為EphB2下游的重要信號分子,可促進(jìn)神經(jīng)突觸形成和重塑,且最近研究表明Src活化后可激活NF-κB (p65)分子。我們推測EphB2可能通過Src-p65信號通路調(diào)控B細(xì)胞活化。另外,一種新近發(fā)現(xiàn)的信號分子Notch1可參與T細(xì)胞活化,但其在B細(xì)胞活化中的作用尚不明確。此部分我們將探究上述信號分子在EphB2調(diào)控B細(xì)胞活化中的作用。方法：通過轉(zhuǎn)染EphB2 siRNA或miR-185模擬物寡聚核苷酸以抑制B細(xì)胞EphB2表達(dá),western blot分別檢測B細(xì)胞phospho-Src/總Src、phospho-p65/總p65及Notch1蛋白水平,以探究EphB2調(diào)控B細(xì)胞活化中可能激活的信號通路。結(jié)果：與對照組相比,EphB2 siRNA和miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細(xì)胞磷酸化Src表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05),各組B細(xì)胞總Src表達(dá)無明顯差異；磷酸化p65表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05),各組B細(xì)胞總p65表達(dá)無明顯差異。同時(shí),EphB2 siRNA和miR-185模擬物轉(zhuǎn)染組B細(xì)胞中Notch1的表達(dá)受到顯著抑制(P0.05)。結(jié)論：EphB2可能通過Src-p65信號通路調(diào)控B細(xì)胞活化,Notch1也在其中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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本文編號：2305813