發(fā)布時間：2018-11-02 10:56

【摘要】：第一部分EphB2在B細胞上表達及其作用的初步研究背景：EphB2是受體型酪氨酸激酶Eph家族成員,主要表達于腫瘤細胞和內皮細胞上,可促進腫瘤細胞增殖和遷移及內皮細胞簇集。近年研究發(fā)現,EphB2在T細胞和單核細胞上也有表達,并且其前向信號可促進T細胞遷移和單核細胞活化。然而,EphB2在B細胞上的表達及作用至今尚無明確報道。方法：取健康志愿者靜脈血,分選出B淋巴細胞。分別利用LPS、anti-IgM和IL-4刺激幼稚B細胞活化,以western blot檢測EphB2及其配體ephrinB1/B2蛋白表達情況。同時,通過轉染EphB2 siRNA以抑制EphB2表達,并設立陰性對照siRNA(NC)轉染組和非轉染對照組,檢測其對B細胞增殖、分泌細胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗體水平的影響。結果：EphB2及其特異性配體ephrinB1和ephrinB2在人外周血幼稚B細胞上均有表達,且體外刺激B細胞活化后,EphB2表達顯著上調(P0.05),而ephrinB1和ephrinB2表達均無明顯變化。同時,轉染siRNA并檢測B細胞活化指標,結果顯示,與NC轉染組和非轉染對照組相比,EphB2 siRNA轉染組B細胞增殖(P0.05)、B細胞培養(yǎng)上清TNF-α (P0.01)及IgG水平(P0.05)均顯著下降,然而各組之間IgM水平無明顯差異。結論：EphB2及其配體ephrinB1/B2在人B細胞上有表達,且EphB2在B細胞活化中起到重要的促進作用。第二部分調控B細胞EphB2表達的microRNA的篩選和鑒定背景：microRNA是一種內源性的、長度約為20-24個核苷酸的小RNA,通過與mRNA特異性結合使其降解或抑制其翻譯為蛋白質,并因其穩(wěn)定性、保守性及靶向結合的特異性,成為疾病分子靶向治療方面的研究熱點。有研究顯示,在神經膠質瘤細胞和血管內皮細胞中,EphB2表達可受到多種microRNA的調控。因此,篩選出具有特異性調控B細胞EphB2表達的microRNA對進一步研究EphB2在B細胞中的作用機制有重要價值。方法：利用miRWalk數據庫并綜合參考5種生物信息學分析結果,預測可調控人EphB2表達的microRNAs,并利用實時定量PCR檢測上述microRNAs在B細胞中的表達情況。之后,構建含有EphB2 3'UTR結合位點的熒光霉素報告基因載體質粒,并與miR-185模擬物或模擬物NC共轉染入工具細胞293T內,檢測各組細胞的熒光值,以驗證miR-185是否可與EphB2 mRNA特異性結合并影響EphB2表達。另外,通過轉染miR-185模擬物和抑制劑進入B細胞,并western檢測B細胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2 (+) B細胞百分比和平均熒光強度,以進一步驗證miR-185是否可影響B(tài)細胞上EphB2的表達;同時,檢測B細胞增殖、分泌細胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗體水平,以探究miR-185對B細胞活化的影響。結果：miRWalk數據庫預測出miRNA-185、miRNA-661、miRNA-593、 miRNA-211、miRNA-515和miRNA-204這6種microRNA可調控人EphB2表達。上述6種microRNA在人外周血幼稚B細胞中均有表達,然而只有miRNA-185, miRNA-515和miRNA-204在活化的B細胞中表達下調(P0.05),且與miRNA-515和miRNA-204相比,miRNA-185下調更為明顯(P0.05)。熒光霉素報告基因結果顯示,含EphB2 3'UTR野生型結合位點的報告基因與miRNA-185模擬物共轉染組細胞熒光測值下降41%(P0.01)。進一步,我們分別轉染miR-185模擬物和抑制劑進入B細胞,檢測到與NC組和非轉染對照組相比,miR-185模擬物轉染組中western檢測B細胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2 (+) B細胞百分比和平均熒光強度均明顯下調(P0.05), miR-185抑制劑轉染組中western檢測B細胞EphB2蛋白水平、流式檢測EphB2 (+) B細胞百分比和平均熒光強度均明顯上調(P0.05)：同時,我們檢測各組B細胞活化指標,結果顯示,miR-185模擬物轉染組B細胞增殖(P0.05)、B細胞培養(yǎng)上清TNF-α (P0.01)及IgG水平(P0.05)均顯著下降,miR-185抑制劑轉染組B細胞增殖(P0.05)、B細胞培養(yǎng)上清TNF-α (P0.01)及IgG水平(P0.05)均顯著上升。結論：miR-185可特異性抑制B細胞上EphB2表達,從而阻礙B細胞活化。第三部分EphB2調控B細胞活化的分子機制背景：細胞活化的核心轉錄因子為NF-κB,其亞基p65是B細胞活化中的重要信號分子。在神經細胞中,Src為EphB2下游的重要信號分子,可促進神經突觸形成和重塑,且最近研究表明Src活化后可激活NF-κB (p65)分子。我們推測EphB2可能通過Src-p65信號通路調控B細胞活化。另外,一種新近發(fā)現的信號分子Notch1可參與T細胞活化,但其在B細胞活化中的作用尚不明確。此部分我們將探究上述信號分子在EphB2調控B細胞活化中的作用。方法：通過轉染EphB2 siRNA或miR-185模擬物寡聚核苷酸以抑制B細胞EphB2表達,western blot分別檢測B細胞phospho-Src/總Src、phospho-p65/總p65及Notch1蛋白水平,以探究EphB2調控B細胞活化中可能激活的信號通路。結果：與對照組相比,EphB2 siRNA和miR-185模擬物轉染組B細胞磷酸化Src表達顯著下調(P0.05),各組B細胞總Src表達無明顯差異；磷酸化p65表達顯著下調(P0.05),各組B細胞總p65表達無明顯差異。同時,EphB2 siRNA和miR-185模擬物轉染組B細胞中Notch1的表達受到顯著抑制(P0.05)。結論：EphB2可能通過Src-p65信號通路調控B細胞活化,Notch1也在其中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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本文編號：2305813