【摘要】：背景：人副流感病毒3型(human parainfluenza virus 3, HPIV3)是一種含有不分節(jié)段的單股負鏈RNA基因組的包膜病毒,為副粘病毒科(paramyxoviridae)副粘病毒屬(paramyxovirus)的家族成員之一。在全球范圍內(nèi),HPIV3主要引起5歲以下嬰幼兒的上下呼吸道感染,例如肺炎、細支氣管炎、喉炎等。當前仍沒有安全有效的疫苗和抗病毒藥物來預防和治療該病毒引起的感染,而開發(fā)疫苗和藥物的主要障礙在于對該病毒感染宿主細胞的機制還不清楚,因此必須進一步弄清HPIV3的致病機制。HPIV3入侵宿主細胞的先決條件為病毒包膜和宿主細胞膜的融合,同時細胞膜之間的融合也是HPIV3入侵宿主細胞的典型病理特征,該過程主要是通過同源性血凝素-神經(jīng)氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase, HN)蛋白協(xié)助,由融合(fusion, F)蛋白介導完成的。F蛋白為型病毒糖蛋白,最初合成的是非活化的蛋白前體F0,經(jīng)過加工修飾后被宿主細胞蛋白酶裂解為二硫鍵連接的F1和F2。研究表明F蛋白上的多個結構域?qū)δと诤匣钚杂兄匾饔谩Ｆ渲腥诤想?fusion peptide, FP)能夠插入宿主細胞膜中從而啟動膜融合過程；兩個疏水性的七重復基元(heptad repeat motif,HR),即HRA和HRB,具有很強的親和力,能夠在膜融合過程中形成穩(wěn)定的6-螺旋束(six-helical bundle,6HB)促進病毒包膜和靶細胞膜的融合；而跨膜區(qū)(transmembrane region, TM)為形成融合小孔所必須。在HRA和HRB之間有大約250個氨基酸(amino acid, aa),主要包括三個結構域(DⅠ-DⅢ)和兩個連接區(qū)(DⅠ-DⅡ連接區(qū)和HRB連接區(qū))。DⅠ-DⅡ連接區(qū)(369aa-374aa)連接結構域DⅠ和DⅡ,HRB連接區(qū)連接結構域DⅡ和HRB。當前只有HPIV3 F蛋白融后合構象的X-射線晶體結構是已知的,且HRA、HRB、結構域DⅠ-DⅢ和兩個連接區(qū)均可在該結構上觀察到。到目前為止,雖然已有F蛋白的多個結構域?qū)δと诤匣钚杂绊懙膱蟮?但DⅠ-DⅡ連接區(qū)對膜融合活性的影響還未有報道。目的：確定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)對膜融合活性的影響,探討DⅠ-DⅡ連接區(qū)影響膜融合功能的機制,以期為研究安全有效的疫苗和抗病毒藥物提供線索。方法：1.采用蛋白同源建模的方法在SWISS-MODEL軟件上以PIV5(parainfluenza virus 5, PIV5) F蛋白融合前構象的晶體結構(PDB ID:4GIP)為模板得到HPIV3 F蛋白的融合前構象的模型,以確定DⅠ-DⅡ連接區(qū)在融合前構象上的位置。2.采用定點突變和體內(nèi)同源重組相結合的方法構建出該區(qū)域(369aa-374aa)的九個單氨基酸突變體,測序確定構建成功后將它們在真核瞬時表達系統(tǒng)內(nèi)進行蛋白表達。3.采用三種不同類型的膜融合試驗,即吉姆薩染色法,指示基因法,染料轉(zhuǎn)移法,定性和定量檢測各突變體蛋白對膜融合功能的影響。4.采用流式細胞術來檢測各突變體F蛋白在細胞表面的表達效率。5.采用免疫共沉淀試驗來檢測各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白在細胞表面的相互作用能力。6.采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,應用Student's t-檢驗對突變體和野生型F蛋白的實驗數(shù)據(jù)進行分析比較,P0.05被認為差別具有統(tǒng)計學意義。結果：1.成功構建出HPIV3 F蛋白融合前構象的同源結構模型,通過氨基酸序列比對確定了HPIV3 F蛋白融合后構象的DⅠ-DⅡ連接區(qū)(369-374aa)在它的融合前構象中仍然扮演DⅠ-DⅡ連接區(qū)的角色。HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)的9個單氨基酸突變體(K369A、K369E、S370A、D371A、I372A、V373A、V373T、P374A和P374T)均構建成功。2.各突變體F蛋白在膜融合過程的所有階段均表現(xiàn)出降低的膜融合活性。與野生型蛋白相比,突變體F蛋白形成的合胞體不僅數(shù)目減少而且面積也較小,其中K369E、S370A、V373A、V373T和P374T突變體幾乎喪失了形成合胞體的能力,僅為野生型的5%以下,內(nèi)容物混合的能力也極度降低,分別為野生型的18.0%、17.3%、 16.4%、18.9%和15.4%,同時它們的半融合活性也大幅度降低,半融合的速率和程度均低于野生型水平的15%；而剩下的4個突變體(K369A、D371A、I372A和P374A)雖具有合胞體形成能力,但均低于野生型水平,其中K369A和D371A突變體內(nèi)容物混合的能力均約為野生型的66.7%,半融合的速率和程度約為野生型水平的五分之四(82.2%、82.0%)和四分之三(74.5%、75.2%),而1372A和P374A突變體內(nèi)容物混合的能力分別為野生型的水平的57.6%和54.5%,半融合的速率分別降低到野生型水平的58.5%和51.8%,半融合的程度分別降低為野生型的62.6%和60.6%。3.DⅠ-DⅡ連接區(qū)的突變對F蛋白在細胞表面的表達水平無影響。各突變體F蛋白在細胞表面的表達水平均處于野生型F蛋白的93.1%-105.9%之間,與野生型相比差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.DⅠ-DⅡ連接區(qū)的各突變體與HPIV3 HN蛋白在細胞表面的相互作用能力均降低,其中K369E、V373A、V373T和P374T這4個突變體幾乎喪失了與HN蛋白相互作用的能力,均低于野生型水平的10%；S370A突變體與HN蛋白相互作用的能力約為野生型的五分之一；K369A、D371A、I372A和P374A突變體與HN蛋白相互作用的能力分別為野生型的41.4%、66.0%、26.9%和15.2%。結論：HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)對膜融合功能有重要影響,且各氨基酸殘基對膜融合活性影響的程度不同。膜融合活性的降低可能是由于突變導致各突變體F蛋白與同源性HN蛋白在細胞表面的相互作用能力降低所致。背景：HPIV3入侵宿主細胞是通過病毒包膜和靶細胞膜的融合來實現(xiàn)的,該過程能將單負鏈不分節(jié)段的RNA基因組導入宿主細胞質(zhì)內(nèi),是病毒完成生命周期的關鍵步驟。HPIV3包膜上有兩種與膜融合相關的糖蛋白,即HN蛋白和F蛋白,兩者協(xié)同完成了該過程。HN蛋白負責介導病毒與靶細胞表面的吸附,而F蛋白則直接介導膜融合過程。在F蛋白HRA和HRB之間有一段過渡性的區(qū)域,主要包含三個結構域DⅠ,DⅡ和DⅢ,它們通過連接區(qū)相連。DⅠ和DⅡ結構域由DⅠ-DⅡ連接區(qū)(369aa-374aa)連接；DⅡ和HRB結構域由HRB連接區(qū)連接；D1和D3結構域直接相連,兩者之間并沒有氨基酸序列連接,所以我們定義為“偽連接區(qū)”,對該區(qū)域的氨基酸進行序列比對后發(fā)現(xiàn)其含有亮氨酸拉鏈類似結構。亮氨酸拉鏈類似結構是一種特殊的類七重復基元結構,最顯著的特征是亮氨酸或異亮氨酸總是有規(guī)律地每隔6個氨基酸就出現(xiàn)一次,將該氨基酸序列用假想的α螺旋輪展示時,第“a”位的全部氨基酸殘基和第“d”位的大部分氨基酸殘基均為非極性氨基酸。對三種不同副粘病毒融合蛋白亮氨酸拉鏈類似結構的研究表明該基序?qū)δと诤匣钚杂兄匾绊�。然而位于HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)的亮氨酸拉鏈類似結構對膜融合活性的影響尚未見報道。目的：確定HPIV3F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)亮氨酸拉鏈類似結構對膜融合活性的影響,尋找亮氨酸拉鏈類似結構干擾膜融合功能的機制。方法：采用PCR定點突變和體內(nèi)同源重組相結合的方法將該區(qū)域的亮氨酸和其它保守氨基酸(L257、V264、L271、L278、L285、Q292和I299)分別突變?yōu)楸彼?同時將中間的三個高度保守的亮氨酸(L271、L278和L285)進行了聯(lián)合突變,應用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬時表達系統(tǒng)于BHK-21細胞內(nèi)進行蛋白表達,之后采用合胞體形成試驗、內(nèi)容物混合試驗、R18探針試驗,半融合動力學試驗檢測突變對膜融合功能的影響；采用流式細胞術檢測各突變體F蛋白在細胞表面的表達水平；采用免疫共沉淀試驗來檢測突變對HN蛋白和F蛋白在細胞表面的相互作用能力的影響。采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,應用Student's t-檢驗對突變體和野生型F蛋白的實驗數(shù)據(jù)進行分析比較,P0.05被認為差別具有統(tǒng)計學意義。結果：1.應用PCR單點突變和聯(lián)合突變的方法成功構建出了HPIV3F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)亮氨酸拉鏈類似結構的7個單點突變體(L257A、V264A、L271A、 L278A、L285A、Q292A和I299A)、3個二聯(lián)突變體(L271A-L278A、L271A-L285A和L278A-L285A)和1個三聯(lián)突變體(L271A-L278A-L285A)。2.各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白共表達時,在膜融合過程的所有階段均表現(xiàn)出降低甚至消失的膜融合活性。與野生型相比,突變體蛋白形成的合胞體不僅數(shù)量減少而且面積也較小,3個單點突變體(L257A、L271A和I299A)和3個二聯(lián)突變體的合胞體形成能力極度降低,低于野生型水平的6.0%,內(nèi)容物混合的能力只有野生型水平的16.0%以下,且只觀察到極少量的半融合事件,半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5%；而V264A、L285A和Q292A這3個突變體的合胞體形成能力略微降低,分別為野生型水平的64.7%、69.1%和68.5%,內(nèi)容物混合的能力仍維持在野生型水平的85%左右,介導半融合能力輕微降低,半融合的速率分別為野生型的88.8%、87.6%和85.0%,半融合的程度分別為野生型的85.5%、87.2%和83.1%；此外,L278A突變體的合胞體形成能力約為野生型水平的38.1%,內(nèi)容物混合的能力只有野生型的一半,半融合的速率和程度分別為野生型水平的52.8%和60.6%；剩下的三聯(lián)突變體喪失了合胞體形成能力,內(nèi)容物混合能力僅為野生型的2.2%,也沒有觀察到半融合事件的發(fā)生,半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5%。3.HPIV3 F蛋白亮氨酸拉鏈類似結構的各丙氨酸取代株在細胞表面的蛋白表達水平均與野生型近似,差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.所有的突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白在細胞表面的相互作用能力均降低,其中三聯(lián)突變體沒有檢測到與HN蛋白的相互作用；3個二聯(lián)突變體與HN蛋白的相互作用能力約為野生型的一半；L257A.L271A和I299A突變體與HN蛋白的相互作用能力低于野生型水平的30%:V264A.L278A.L285A和Q292A突變體與HN蛋白的相互作用能力分別為野生型水平的63.3%、65.1%、64.3%和66.7%。結論：HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)的亮氨酸拉鏈類似結構對膜融合活性有重要影響；其中三聯(lián)突變體對膜融合活性的影響最大；該結構的完整性是完成膜融合過程必不可少的。背景：HPIV3F蛋白屬于Ⅰ型病毒膜融合蛋白,通常先合成非活化的前體蛋白F0,然后在宿主細胞蛋白水解酶的作用下裂解為二硫鍵連接的F1和F2。已有研究表明F1亞單位上的FP、HRA和HRB能夠在細胞融合過程中發(fā)揮重要作用。值得注意的是,Yin等發(fā)現(xiàn)在副流感病毒5型(parainfluenza virus 5, PFIV5) F蛋白融合前構象的X射線晶體結構中HRB的N-端有一段電子密度較弱的區(qū)域,即HRB連接區(qū)。對新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) F蛋白HRB連接區(qū)的第454位谷氨酰胺(glutamine, Q)進行氨基酸突變分析后發(fā)現(xiàn)其對膜融合活性有重要影響。Russell等在猴病毒5型(Simian virus 5, SV5) F蛋白HRB的N-端靠近HRB結構域的連接區(qū)內(nèi)構建突變體發(fā)現(xiàn)第447位亮氨酸(leucine, L)和第449位異亮氨酸(isoleucine, I)是影響F蛋白融合功能和形成六螺旋束(6HB)的關鍵氨基酸,提示HRB連接區(qū)域可能具有類似“開關”F蛋白構象折疊的作用；目前對HPIV3F蛋白HRB連接區(qū)對膜融合功能的影響尚不清楚。目的：確定HPIV3F蛋白HRB連接區(qū)對膜融合功能的影響,探討該區(qū)域影響膜融合功能的機制。方法：采用定點突變和體內(nèi)同源重組相結合的方法將HRB連接區(qū)內(nèi)的T429、E432、1443和N446位氨基酸進行單點突變,應用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬時表達系統(tǒng)于BHK-21細胞內(nèi)進行蛋白表達,之后采用吉姆薩染色法、指示基因法、染料轉(zhuǎn)移法檢測突變對膜融合活性的影響；采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,應用Student's t-檢驗對突變體和野生型F蛋白的實驗數(shù)據(jù)進行分析比較,P0.05被認為差別具有統(tǒng)計學意義。結果：1.成功構建了HRB連接區(qū)的6個突變體T429A、T429L、E432A、I443A、N446A和N446S。2.各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白共表達時,膜融合活性表現(xiàn)為兩種類型。T429A、T429L和N446A這3個突變體形成的合胞體不僅個數(shù)少,而且面積也比較小,內(nèi)容物混合的能力也降低,只有野生型水平的36.6%、42.3%和15.2%,同時半融合活性只有野生型水平的34.8%、42.7%和12.4%；而E432A、I443A和N446S這3個突變體的膜融合活性均比野生型略增強,分別相當于野生型的109.4%、113.2%和118.6%,但半融合活性差別無統(tǒng)計學意義。結論：HPIV3 F蛋白HRB連接區(qū)內(nèi)的氨基酸突變對細胞融合活性有重要影響,其中N446為關鍵氨基酸位點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373.13
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本文編號：2293796