【摘要】：金黃色葡萄球菌是引起感染的常見(jiàn)的病原菌,特別是社區(qū)相關(guān)性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)的出現(xiàn),嚴(yán)重的威脅到人類的健康。CA-MRSA的輕微感染會(huì)引起皮膚或軟組織等定植感染,嚴(yán)重感染可引起比如膿毒癥、中毒性休克綜合征等。一些臨床癥狀顯示,在金葡菌引起的嚴(yán)重感染的前期伴隨有水腫、低血壓,血漿滲漏等現(xiàn)象,疾病后期則會(huì)演變?yōu)樾菘�、多器官衰竭等癥狀,這些現(xiàn)象表明在金葡菌感染的過(guò)程中存在重要的病理學(xué)變化-血管內(nèi)皮屏障的損傷。文獻(xiàn)調(diào)研顯示,目前已報(bào)道的金葡菌感染引起內(nèi)皮屏障通透性改變的主要毒力因子有四種:超抗原類蛋白、α-溶血素、殺白細(xì)胞素和半胱氨酸蛋白酶類,通過(guò)直接或間接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞影響血管通透性。除此之外,一些臨床上的研究顯示仍有一些未知的作用機(jī)制。在對(duì)膿毒癥的臨床研究中發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞(PMN)來(lái)源的肝素結(jié)合蛋白(HBP)在細(xì)菌性膿毒癥發(fā)生的過(guò)程中可以監(jiān)控病程發(fā)展以及預(yù)后,而且與血管通透性的改變關(guān)系密切。在研究A族鏈球菌引起膿毒癥的致病機(jī)制中發(fā)現(xiàn),鏈球菌M蛋白可以與血漿中的纖維蛋白原結(jié)合,然后通過(guò)β2整合素受體激活PMN脫顆粒釋放HBP,引起血管滲漏。同樣本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)在豬鏈球菌感染引起的中毒性休克綜合征中,病人血清中的HBP高于正常水平,經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)豬溶素Sly是其重要的刺激因子,這些研究基礎(chǔ)為我們尋找金葡菌毒力因子與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的作用的新機(jī)制提供了重要線索。為了研究金葡菌感染與HBP的關(guān)系,我們首先收集了一些金葡菌嚴(yán)重感染、具有膿毒癥、多器官衰竭等臨床癥狀的病人血清以及一些健康人血清,另外還收集了多株臨床分離的CA-MRSA和HA-MRSA菌株,進(jìn)行刺激HBP釋放的評(píng)價(jià),確定了HBP濃度升高與金葡菌嚴(yán)重感染之間存在顯著相關(guān)性。同時(shí)結(jié)果顯示CAMRSA的刺激能力比HA-MRSA高,這些為我們進(jìn)一步的研究金葡菌中HBP的刺激源奠定了基礎(chǔ)。隨后,為了確定上清中的刺激源,我們從性質(zhì)入手,用蛋白酶K與熱滅活處理確定了刺激源是耐熱蛋白質(zhì),通過(guò)離子交換柱的分離純化并結(jié)合體外活性檢測(cè)以及高分辨率的SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)高活性組分與低活性組分在約3KD處存在差異條帶,然后用乙醇萃取方法將上清中小分子多肽抽離出,經(jīng)過(guò)功能驗(yàn)證后進(jìn)行質(zhì)譜分析,我們共鑒定出了多種活性成分,其中包括3種PSMα(PSMα1,PSMα2,PSMα4)以及δ毒素。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研,α型PSM是金葡菌重要的毒力因子,被認(rèn)為是引起CAMRSA高毒力的原因之一,雖然PSMα1-3對(duì)中性粒細(xì)胞的裂解能力可以達(dá)到80%-90%,但是研究發(fā)現(xiàn)血清中的高密度脂蛋白可以與PSMα結(jié)合導(dǎo)致其功能喪失。隨后有研究報(bào)道PSMα能介導(dǎo)金葡菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)裂解細(xì)胞進(jìn)行逃逸的新功能,這也意味著游離的PSMα1-3在生理?xiàng)l件下可能不能有效的發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步研究質(zhì)譜鑒定出的活性成分與HBP的關(guān)系,我們合成了這五種多肽,用模擬人體內(nèi)環(huán)境的全血體系以及離體PMN加血清的實(shí)驗(yàn)對(duì)它們進(jìn)行HBP釋放功能評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其它三種多肽相比,PSMα4可以擺脫血漿脂蛋白的封閉激活中性粒細(xì)胞釋放HBP,進(jìn)而又通過(guò)敲除株、互補(bǔ)株實(shí)驗(yàn)確定PSMα4是金葡菌上清中重要的HBP刺激源,并通過(guò)觀察CD63分子的移動(dòng)以及髓過(guò)氧化物酶(MPO)和彈性蛋白酶(Elastase)的釋放確定了HBP的釋放是通過(guò)PSMα4激活PMN脫顆粒實(shí)現(xiàn)的。在對(duì)受體和信號(hào)通路的研究中,我們發(fā)現(xiàn)甲�；鶎�(duì)PSMα4功能發(fā)揮有重要作用,而文獻(xiàn)報(bào)道的PSMα引起的PMN趨化與鈣離子內(nèi)流不需要甲�；膮⑴c。說(shuō)明這是FPR2受體介導(dǎo)的兩種不同通路。抑制劑作用發(fā)現(xiàn)PI3K對(duì)HBP釋放起重要作用,與細(xì)胞骨架重排相關(guān)的Rac2分子也可能參與其中。鈣離子螯合劑EGTA以及胞內(nèi)鈣離子探針結(jié)果說(shuō)明PSMα4引起HBP的釋放與鈣離子內(nèi)流也有緊密的聯(lián)系。考慮到PSMα4是PSMα四種甲�；闹形ㄒ豢梢源碳BP釋放的,說(shuō)明除了甲酰基外還有其它的氨基酸位點(diǎn)發(fā)揮作用,我們采用丙氨酸掃描突變法篩選關(guān)鍵位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)了一些位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致PSMα4刺激HBP釋放的能力完全喪失;這些位點(diǎn)究竟如何影響PSMα4的功能有待于進(jìn)一步的研究。接著我們通過(guò)構(gòu)建單層細(xì)胞Transwell模型以及小鼠皮膚滲漏的Miles assay進(jìn)行PSMα4功能評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSMα4與PMN作用后的上清會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,加入HBP抗體后這種影響會(huì)被抑制。同時(shí)也檢測(cè)到了與脫顆粒緊密相關(guān)的呼吸爆發(fā),這些結(jié)果驗(yàn)證了HBP在PSMα4引起血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變中的重要作用。在小鼠皮膚滲漏實(shí)驗(yàn)中,野生株、敲除株和互補(bǔ)株上清以及合成多肽評(píng)價(jià)證明了PSMα4是引起小鼠皮膚血管滲漏的主要原因,通過(guò)抑制劑WRW4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明PSMα4是通過(guò)FPR-2受體介導(dǎo)滲漏。為了進(jìn)一步的驗(yàn)證PMN在這個(gè)過(guò)程中的重要作用,我們構(gòu)建了中性粒細(xì)胞減少癥(neutropenic)小鼠,野生株培養(yǎng)上清和PSMα4多肽在neutropenic小鼠皮膚造成的滲漏明顯低于野生型小鼠。然后我們將分離得到小鼠PMN與PSMα4共孵育上清注射進(jìn)入neutropenic小鼠皮膚內(nèi),與對(duì)照組多肽相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚出現(xiàn)的滲漏更加嚴(yán)重。同時(shí)也檢測(cè)到了可能與HBP同源類似物同儲(chǔ)存于初級(jí)顆粒中的的小鼠髓過(guò)氧化物酶(MPO),這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了在小鼠皮膚上引起血管滲漏的是來(lái)自于中性粒細(xì)胞的分泌物。最后我們用小鼠感染模型來(lái)評(píng)價(jià)PSMα4通過(guò)激活中性粒細(xì)胞脫顆粒引起血管滲漏。我們?nèi)⊙軡B漏現(xiàn)象較明顯的肺部進(jìn)行觀察,通過(guò)肺部的組織切片HE染色與掃描電鏡的觀察結(jié)果可以看出,感染野生株的小鼠肺組織間隙中有明顯的紅細(xì)胞以及血漿的滲出,而敲除株以及PBS對(duì)照組沒(méi)有這種現(xiàn)象。綜上所述,通過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn)金葡菌毒力因子PSMα4可以擺脫血清脂蛋白的封閉通過(guò)FPR-2受體激活中性粒細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生HBP,并在細(xì)胞和小鼠模型中觀察到通透性改變與血管滲漏的現(xiàn)象。一方面從新的角度對(duì)PSMα4功能的獨(dú)特性進(jìn)行詮釋,另一方面論證了PSMα尤其是PSMα4在金葡菌感染中的重要作用,對(duì)于完善補(bǔ)充金葡菌致病機(jī)制特別是對(duì)于膿毒癥、中毒性休克綜合征等重度感染的研究有很好的指導(dǎo)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R378.11

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本文編號(hào)：2261038