【摘要】：目的：為研究減味壽胎丸的安胎機理,用減味壽胎丸高劑量、中劑量、低劑量(以下簡稱高劑量組、中劑量組、低劑量組)、陽性對照藥環(huán)孢素(CsA)四種藥物干預(yù)自然流產(chǎn)(SA)病證結(jié)合模型小鼠,通過酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)檢測血清白介素(IL-17)、蘇木精-伊紅染色法(HE)觀察各組小鼠蛻膜、胚胎、卵巢的形態(tài)學(xué)變化,實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(yīng)法(RT-qPCR)、免疫組化法(IHC)、蛋白印跡法(WB)檢測各組孕小鼠蛻膜組織中IL-17、叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)、維甲酸孤核受體(ROR γt)、孕激素受體PR基因與蛋白的表達差異,進而找出減味壽胎丸在本模型中發(fā)揮安胎機制的作用靶點,并探討減味壽胎丸與CsA是否能逆轉(zhuǎn)SA病證結(jié)合模型小鼠存在的Th17細胞/調(diào)節(jié)性T細胞(Th17/Treg)平衡偏移。方法：1.觀察各組孕小鼠實驗過程中的一般情況、造模及藥物干預(yù)前后的體重變化、胚胎吸收率,ELISA法檢測各組孕小鼠血清IL-17含量的差異。2.RT-qPCR檢測各組孕小鼠妊娠子宮蛻膜組織中IL-17 mRNA、Foxp3 mRNA、ROR γt mRNA、PR mRNA的表達差異；HE染色法觀察各組孕小鼠蛻膜、胚胎及卵巢中卵泡與黃體的形態(tài)學(xué)差異,IHC與WB檢測各組孕小鼠IL-17、Foxp3、PR、ROR γt蛋白表達的差異。結(jié)果：1.造模成功的標準：腎虛的評價：見小鼠畏寒喜暖、蜷縮拱背、體毛枯疏、失去光澤、精神萎頓、倦怠嗜睡,自主活動次數(shù)明顯減少、行動困難,瞇眼、呼吸短促,躁動、易驚；進食量和飲水量下降,大便稀溏(肛門會粘有稀溏臭穢的大便)、小便清長；尾巴發(fā)涼,體溫下降、反應(yīng)遲鈍,體重增長減慢甚至下降,開口變小,消化道澀滯,灌胃困難,有食物反流于口中。部分小鼠出現(xiàn)妊娠期間陰道流血甚至胚胎的排出,符合小鼠腎虛的生理病理表現(xiàn),提示造模成功�？瞻捉M及減味壽胎丸高、中、低劑量組和陽性對照組的小鼠一般狀態(tài)良好,體毛順滑有光澤,精神狀態(tài)良好,活動自如,進食、進水量正常,體重增加,組間差異不大。2.妊娠第0天、第4.5天、第9天,各組孕小鼠體重?zé)o組間差異。妊娠第0天與妊娠第4.5天各組孕小鼠體重有組內(nèi)差異；妊娠第4.5天與妊娠第9天各組孕小鼠體重有組內(nèi)差異。3.各組小鼠胚胎吸收率：模型1組、模型2組與空白組相比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.0016),高劑量組與模型1組相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.0016)；中劑量組、低劑量組、陽性對照組與模型1組相比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.0016)；中劑量組、低劑量組、陽性對照組組間兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.0016)。4.模型1組、模型2組與空白組的孕小鼠血清IL-17水平有顯著差異(P0.01)；模型2組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性藥組與模型1組的孕小鼠血清IL-17水平有顯著差異(P0.01)；高劑量組與中劑量組、低劑量組、陽性對照組相比較,差異具有顯著性(P0.01)；中劑量組與低劑量組相比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；中劑量與陽性對照組相比較,差異具有顯著性(P0.01)；低劑量組與陽性對照組相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.RT-qPCR結(jié)果顯示：小鼠蛻膜組織中Foxp3 mRNA、PR mRNA的表達,模型1組、模型2組較空白組明顯下調(diào),藥物干預(yù)的四個組較模型1組的表達明顯上調(diào)；IL-17mRNA、 ROR γt mRNA模型1組、模型2組較空白組明顯上調(diào),藥物干預(yù)的四個組較模型1組的表達明顯下調(diào)；以上藥物四個組組間上述四個基因的表達未見明顯趨勢性差異。6.免疫組化結(jié)果顯示：小鼠蛻膜組織中Foxp3、PR蛋白的表達,模型1組、模型2組較空白組明顯下調(diào),藥物干預(yù)的四個組較模型1組的表達明顯上調(diào)；IL-17、ROR γt蛋白模型1組、模型2組較空白組明顯上調(diào),藥物干預(yù)的四個組較模型1組的表達明顯下調(diào)。Foxp3、IL-17蛋白的表達,藥物干預(yù)的四個組組間未見明顯趨勢性差異。中藥3個劑量組對PR、ROR γt蛋白表達的調(diào)節(jié)效能均優(yōu)于陽性對照組,但中藥3個劑量組之間未見明顯趨勢性差異。7.蛋白印跡法結(jié)果顯示：小鼠蛻膜組織中Foxp3、PR蛋白的表達,模型1組、模型2組較空白組明顯下調(diào),藥物干預(yù)的四個組較模型1組的表達明顯上調(diào)；IL-17、ROR γt蛋白的表達,模型1組、模型2組較空白組明顯上調(diào),藥物干預(yù)的四個組較模型1組的表達明顯下調(diào)。PR蛋白的表達,藥物干預(yù)的四個組組間未見趨勢性顯著差異,表明中藥3個劑量組與陽性對照組對該蛋白的調(diào)節(jié)效能相似。中藥3個劑量組對Foxp3、 ROR γt蛋白表達的調(diào)節(jié)效能均優(yōu)于陽性對照組,且中藥3個劑量組對二者的調(diào)節(jié)效能呈趨勢性差異,其從高到低排序為：中劑量組低劑量組高劑量組。中藥3個劑量組對IL-17蛋白表達的調(diào)節(jié)效能均優(yōu)于陽性對照組,且中藥3個劑量組對二者的調(diào)節(jié)效能呈趨勢性差異,其從高到低排序為：低劑量組中劑量組高劑量組。結(jié)論：1.本實驗應(yīng)用羥基脲建立SA小鼠CBA/J×DBA/2病證結(jié)合模型,初步得到該模型建立的標準化流程。模型組小鼠妊娠子宮蛻膜組織中存在Foxp3、PR基因與蛋白的低表達,而IL-17、ROR γt基因與蛋白的優(yōu)勢性表達。2.減味壽胎丸不同劑量組可以不同程度的上調(diào)Foxp3基因與蛋白的表達；下調(diào)IL-17、ROR γt基因與蛋白的表達；上調(diào)PR基因與蛋白的表達。3.根據(jù)小鼠胚胎吸收率推論：Foxp3、IL-17、PR、ROR γt基因與蛋白可能為減味壽胎丸與CsA在本病證結(jié)合SA小鼠模型中發(fā)揮安胎機制的作用靶點。本研究提示：IL-17為Th17高特異性分泌,ROR γt為Th17特異性轉(zhuǎn)錄分子,此二者的高表達代表Th17細胞因子的高表達及其優(yōu)勢性地位；Foxp3為Treg的特異性轉(zhuǎn)錄分子,Foxp3的高表達代表Treg細胞因子的高表達及其優(yōu)勢性地位,結(jié)合上述實驗結(jié)果可知,在病證結(jié)合模型中,Th17細胞因子優(yōu)勢性表達；藥物干預(yù)后這一優(yōu)勢性表達發(fā)生逆轉(zhuǎn),呈現(xiàn)Treg細胞因子的優(yōu)勢性表達,可見藥物干預(yù)使病證結(jié)合模型組Th17細胞因子優(yōu)勢性表達轉(zhuǎn)向Treg細胞因子的優(yōu)勢性表達,從而糾正了病證結(jié)合模型組存在的Th17/Treg平衡偏移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R271.9;R-332

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本文編號：2251486