【摘要】：研究背景淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)隸屬于沙粒病毒科家族,自然宿主是嚙齒類動物,常見的如家鼠、寵物鼠、倉鼠等都是它的天然攜帶者。它可以通過唾液、鼻分泌物、乳汁、精液、尿液和糞便使病毒得以傳播,也可以通過其它途徑,如皮膚、粘膜傷口、胎盤甚至病毒粒子氣溶膠的形式傳播。宿主感染了LCMV病毒后大都無明顯的癥狀,這就成為了LCMV可以大面積地隱匿性傳播的前提條件。人們很容易低估了LCMV感染的廣泛性。通過對LCMV的研究,人類在諸如T細胞的MHC限制性、CD8+T細胞和CD4+T細胞在清除病毒過程中作用、T細胞耗竭、免疫耐受等方面取得了里程碑式的重大發(fā)現(xiàn)。其中的Armstrong和Cl-13兩個亞型因為基因組的微小差異而引起宿主急慢性感染的巨大差異被眾多實驗室作為模式病毒,深入地研究免疫系統(tǒng)對急慢性感染的病理變化以及對慢性感染的深入研究。目前對LCMV慢性感染的認識也已經擴展到了HIV、結核病、乙肝、丙肝、自身免疫病和腫瘤的領域。而LCMV可以通過多種途徑實現(xiàn)動物-人的傳播。由于人類感染了LCMV病毒通常無明顯癥狀,或者出現(xiàn)輕微的非特異性癥狀而自愈,故導致人們很容易忽視它的存在。而在特定條件下,如妊娠、免疫功能低下或者器官移植時出現(xiàn)機會感染,對人類健康造成極大威脅。GP2是LCMV穿膜蛋白,位于LCMV粒子表面,同GP1共同起修飾病毒表面的作用,同時它在病毒感染宿主細胞時擔負了通過變構而觸發(fā)病毒膜與細胞膜的融合功能。但目前國內外實驗室對于LCMV的檢測仍在使用免疫血清或者RT-PCR法,到目前為止暫未出現(xiàn)抗LCMV GP2的單克隆抗體的商品,因此研發(fā)抗LCMV GP2的mAb在科研和臨床有重要的現(xiàn)實意義。研究目的本研究的目的是制備針對LCMV GP2的m Ab,為開發(fā)酶標或者熒光標記的檢測抗體打下基礎,為以后的免疫治療提供可能;也可以利用該抗體親和純化GP2,從而進一步研究其結構和功能、LCMV疫苗的開發(fā)做好物質準備。實驗方法采用雜交技術獲得并篩選出雜交瘤細胞,收集含mAb的培養(yǎng)上清行免疫熒光(IFA)、dot-blot、ELISA法鑒定抗體重鏈類型和測定mAb的免疫效價。用蛋白G Sepharose親和層析填料純化抗體,純化后的抗體采用SDS-PAGE檢測純化效果,并進一步用Western-blot檢查抗體對LCMV的作用部位。實驗結果成功獲得能穩(wěn)定分泌抗LCMV的特異性雜交瘤細胞株,順利獲得純化的mAb。IFA、dot-blot結果均證實獲得的mAb能識別LCMV抗原。用ELISA法鑒定出該mAb重鏈類型為IgG2b,培養(yǎng)液免疫效價約為1.35×103。蛋白G親和層析填料純化抗體后經SDS-PAGE考馬斯亮藍R250檢測證實純化抗體純度高。Western-blot提示該m Ab對LCMV的作用部位為病毒顆粒表面糖蛋白抗原GP2。結論成功制備出了針對LCMV病毒顆粒表面糖蛋白抗原GP2高親和力的m Ab,抗體類型是IgG2b。
[Abstract]:Background Lymphocytic choroid plexitis virus (LCMV) belongs to the family of the family Sagituliviridae, and its natural host is rodent, common such as domestic mouse, pet mouse, hamster and so on. It can be transmitted through saliva, nasal secretions, milk, semen, urine and faeces. It can also be transmitted in other ways, such as skin, mucosal wounds, placenta and even viral aerosols. Most of the hosts infected with LCMV virus have no obvious symptoms, which becomes the precondition for LCMV to be widely concealed. It is easy to underestimate the prevalence of LCMV infection. Through the study of LCMV, we have made a landmark discovery in such aspects as T cell MHC restricted CD8 T cells and CD4 T cells in the process of eliminating virus. The function of T cells is depletion of T cells, immune tolerance and so on. The two subtypes of Armstrong and Cl-13 have been used as model viruses in many laboratories because of the small differences in genomes that cause acute and chronic infection of the host. To study the pathological changes of the immune system in acute and chronic infection and the chronic infection. Knowledge of chronic LCMV infection has also expanded to include HIV, tuberculosis, hepatitis B, hepatitis C, autoimmune disease and cancer. And LCMV can achieve animal-human transmission through a variety of ways. It is easy to ignore the presence of LCMV virus in humans because it is usually asymptomatic or self-healing with mild nonspecific symptoms. Under certain conditions, such as pregnancy, low immune function or opportunistic infection during organ transplantation, GP2 is a great threat to human health. GP2 is a membrane penetrating protein of LCMV, which is located on the surface of LCMV particles and acts together with GP1 to modify the surface of virus. At the same time, it is responsible for the fusion function of virus membrane and cell membrane when the virus infects the host cell. But at present, the detection of LCMV in domestic and foreign laboratories is still using immune serum or RT-PCR method, so far, there are no monoclonal antibodies to LCMV GP2, so it is of great practical significance to develop anti-LCMV GP2 mAb in scientific research and clinic. Objective the purpose of this study was to prepare m Ab, for LCMV GP2 to lay a foundation for the development of enzyme-labeled or fluorescent labeled antibodies, and to provide the possibility for immunotherapy in the future. It can also be used to purify GP2, by affinity to further study its structure and function and to prepare for the development of LCMV vaccine. Methods hybridoma cells were obtained and screened by hybridization technique. The supernatants containing mAb were collected and immunofluorescence (IFA) dot-blot Elisa was used to identify the type of antibody heavy chain and determine the immunoreactivity of mAb. The antibody was purified with protein G Sepharose affinity chromatography filler. The purified antibody was detected by SDS-PAGE, and the effect of the antibody on LCMV was further examined by Western-blot. The results showed that the specific hybridoma cell lines secreting LCMV stably were successfully obtained, and the purified mAb.IFA,dot-blot showed that the obtained mAb could recognize the LCMV antigen. The immunoreactivity of the mAb heavy chain type to IgG2b, culture medium was 1.35 脳 103, which was identified by ELISA method. The purified antibody was confirmed by SDS-PAGE Coomassie brilliant Blue R250 after purified by protein G affinity chromatography. Western-blot indicated that the site of the effect of m Ab on LCMV was the surface glycoprotein antigen GP2. of virus particles. Conclusion the type of m Ab, antibody against LCMV virus surface glycoprotein antigen GP2 with high affinity is IgG2b..
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392-33

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