【摘要】：人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)是引起嬰幼兒呼吸系統(tǒng)感染的重要病原體,主要引起嬰幼兒上、下呼吸道感染。雖然目前研究認(rèn)為副黏病毒科病毒通過(guò)與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合啟動(dòng)入胞,但是hMPV的具體入胞途徑并不是很清楚。病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式主要有兩種:膜融合和胞吞。本課題組首先對(duì)hMPV是以膜融合還是胞吞入胞進(jìn)行了研究。通過(guò)間接免疫熒光、R18融合實(shí)驗(yàn)、R18/DiOC雙波長(zhǎng)成像實(shí)驗(yàn)證明了hMPV在進(jìn)入Vero E6細(xì)胞時(shí)存在胞吞的入胞方式。胞吞需要經(jīng)歷一系列復(fù)雜的過(guò)程,而脂筏(lipid raft)廣泛的存在于細(xì)胞膜表面,因此本課題組對(duì)hMPV胞吞過(guò)程中是否有脂筏的參與進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)hMPV入胞過(guò)程的形態(tài)學(xué)研究、化學(xué)阻斷劑處理等方面證明了脂筏參與了hMPV的入胞過(guò)程并在入胞過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。第一部分:人偏肺病毒以胞吞方式入胞的研究目的:探究hMPV在Vero E6細(xì)胞中的入胞方式,通過(guò)對(duì)其入胞機(jī)制的研究尋找出一種有效的阻斷hMPV感染的的手段。方法:首先將100μl h MPV(MOI=10)接種到Vero E6細(xì)胞,分別在感染后的0 min、30 min、60 min、120 min洗去游離的hMPV并固定細(xì)胞;用帶綠色熒光的抗體標(biāo)記病毒包膜的融合蛋白(F蛋白),用帶紅色熒光的抗體標(biāo)記位于胞核的核心蛋白(n蛋白),通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察在感染后0min、30min、60min、120min時(shí)進(jìn)入veroe6細(xì)胞的hmpv數(shù)量及其在細(xì)胞中所處的位置。然后用r18染料對(duì)hmpv包膜染色,用染色后的hmpv感染veroe6細(xì)胞并用激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)拍攝4h以觀察hmpv在veroe6細(xì)胞胞質(zhì)中是否有膜融合的發(fā)生。最后用dioc和r18兩種染料對(duì)hmpv包膜染色,用染色后的hmpv感染veroe6細(xì)胞并用激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)拍攝2h以觀察hmpv在veroe6細(xì)胞發(fā)生膜融合的位置。結(jié)果:熒光抗體對(duì)hmpvf蛋白和n蛋白進(jìn)行標(biāo)記后發(fā)現(xiàn),在不同的時(shí)間點(diǎn)均能觀察到在veroe6細(xì)胞中f蛋白和n蛋白存在共定位并且隨著時(shí)間的增加共定位點(diǎn)數(shù)量也逐漸增加。此結(jié)果表明hmpv在進(jìn)入veroe6細(xì)胞時(shí)可以保持病毒顆粒結(jié)構(gòu)的完整。r18融合實(shí)驗(yàn)觀察到細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光并且隨著時(shí)間的增加紅色熒光逐漸增多,說(shuō)明hmpv在入胞過(guò)程中發(fā)生膜融合。dioc/r18融合實(shí)驗(yàn)中整個(gè)過(guò)程均有紅色熒光出現(xiàn)并逐漸向胞質(zhì)內(nèi)移動(dòng),而綠色熒光比紅色熒光出現(xiàn)晚,黃色熒光在30min以后出現(xiàn)一個(gè)急劇上升的過(guò)程,說(shuō)明在30min后hmpv包膜與細(xì)胞膜發(fā)生膜融合并且膜融合發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)證明了hmpv存在胞吞的方式進(jìn)入veroe6細(xì)胞,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,首先用間接免疫熒光證明了hmpv可以完整的進(jìn)入細(xì)胞;然后用r18融合實(shí)驗(yàn)證明了hmpv在進(jìn)入細(xì)胞時(shí)與細(xì)胞膜發(fā)生了膜融合;最后用r18/dioc融合實(shí)驗(yàn)證明了hmpv入胞30min時(shí)發(fā)生膜融合并且膜融合發(fā)生的部位在胞質(zhì)內(nèi),這些實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了hmpv存在胞吞的方式進(jìn)入Vero E6細(xì)胞。第二部分:脂筏在人偏肺病毒感染宿主細(xì)胞中的作用機(jī)制研究目的:探究脂筏是否參與了人偏肺病毒入胞的過(guò)程,通過(guò)對(duì)脂筏的研究進(jìn)一步了解h MPV入胞過(guò)程。方法:h MPV接種病毒后在培養(yǎng)基中加入霍亂毒素亞單位(CTB)同時(shí)作用6HBE細(xì)胞,分別在感染后的0 min、30 min、60 min、120 min固定細(xì)胞,用帶紅色熒光的抗體標(biāo)記h MPV融合蛋白(F蛋白),激光共聚焦顯微鏡觀察CTB與h MPV在不同時(shí)間點(diǎn)的位置關(guān)系;分別用1mg/ml、5 mg/ml、7.5 mg/ml MβCD和10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml Nystatin處理16HBE細(xì)胞后感染h MPV,感染24 h后用熒光定量PCR檢測(cè)不同處理組h MPV滴度。將50μg/ml、100μg/ml外源性膽固醇加入5 mg/ml MβCD處理后的16HBE細(xì)胞,接毒后24 h用熒光定量PCR檢測(cè)h MPV滴度。結(jié)果:h MPV在進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)與脂筏標(biāo)記物霍亂毒素亞單位存在共定位,并且隨著時(shí)間的增加,共定位點(diǎn)逐漸增加;h MPV伴隨著CTB逐漸向胞核方向移。MβCD處理后,隨著藥物濃度的逐漸升高h(yuǎn) MPV滴度分別降低了81%、90%和98%;Nystatin處理后,隨著藥物濃度的逐漸升高h(yuǎn) MPV滴度分別降低了44%、63%和89%。向5 mg/ml MβCD處理后的16HBE細(xì)胞中加入外源性膽固醇,當(dāng)膽固醇濃度達(dá)到100μg/ml時(shí),h MPV感染顯著升高;添加外源性膽固醇后h MPV滴度時(shí)藥物處理組的4倍。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)證明了脂筏參與了人偏肺病毒胞吞過(guò)程并在胞吞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。首先用CTB來(lái)標(biāo)記脂筏,通過(guò)CTB來(lái)觀察不同時(shí)間點(diǎn)脂筏與h MPV位置關(guān)系;然后用了MβCD、Nystatin兩種破壞脂筏的藥物處理細(xì)胞來(lái)檢測(cè)脂筏破壞對(duì)h MPV感染的影響;最后通過(guò)外源性膽固醇補(bǔ)救檢測(cè)添加外源性膽固醇是否可以恢復(fù)h MPV感染,這些實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了脂筏參與了人偏肺病毒胞吞過(guò)程。
[Abstract]:Human metapneumovirus (hMPV) is an important pathogen causing respiratory tract infections in infants and young children. It mainly causes upper and lower respiratory tract infections in infants and young children. There are two main types of host cells: membrane fusion and endocytosis. In this study, we first studied whether hMPV is membrane fusion or endocytosis. Indirect immunofluorescence, R18 fusion, and R18/DiOC dual-wavelength imaging demonstrated that hMPV has endocytosis when it enters Vero E6 cells. Lipid raft is widely distributed on the surface of cell membrane, so we have studied whether lipid raft is involved in the process of hMPV endocytosis. Part I: The purpose of this study is to explore the entry mode of hMPV into Vero E6 cells by endocytosis, and to find an effective way to block the infection of hMPV through the study of its entry mechanism. Free hMPV was washed and fixed at 60 min, 120 min. The fusion protein (F protein) coated with green fluorescent antibody was labeled and the core protein (n protein) located in the nucleus was labeled with red fluorescent antibody. The number of hMPV entering veroe6 cells at 0 min, 30 min, 60 min and 120 min after infection and the number of hMPV entering veroe6 cells were observed by laser confocal microscopy. The location of hMPV in the cells was observed by R18 dye. the cells were infected with the stained hMPV for 4 hours. the fusion of hMPV in the cytoplasm of veroe 6 cells was observed by confocal laser microscopy. finally, the hMPV envelope was stained with dioc and R18 dyes, and veroe 6 cells were infected with the stained hMPV Results: Fluorescent antibody labeling of hMPV F protein and N protein showed that co-localization of F protein and N protein was observed in veroe 6 cells at different time points and the number of co-localization points increased with time. The results showed that Hpv maintained the integrity of virus granule structure when it entered veroe 6 cells. In R18 fusion experiment, red fluorescence was observed and increased gradually with the increase of time, indicating that membrane fusion occurred during the process of entry. In dioc / R18 fusion experiment, red fluorescence was observed throughout the whole process. The green fluorescence appeared later than the red fluorescence, and the yellow fluorescence showed a sharp rise after 30 minutes, indicating that the membrane fusion between the hMPV envelope and the cell membrane occurred in the cytoplasm after 30 minutes. In the process of experiment, indirect immunofluorescence was used to prove that hMPV could enter the cell completely; then R18 fusion experiment was used to prove that hMPV fused with the cell membrane when it entered the cell; finally, R18 / dioc fusion experiment was used to prove that the membrane fusion took place in the cytoplasm when hMPV entered the cell for 30 minutes, and the location of membrane fusion took place in the cytoplasm. Objective: To investigate the role of lipid rafts in the process of human metapneumovirus (HMPV) entry into Vero E6 cells, and to further understand the process of HMPV entry through the study of lipid rafts. Cholera toxin subunit (CTB) was added to 6 HBE cells at the same time. Fixed cells were immobilized at 0, 30, 60 and 120 minutes after infection, labeled with red fluorescent antibodies for fusion protein of h-MPV (F protein), and the relationship between CTB and h-MPV at different time points was observed by confocal laser microscopy. H MPV titer was detected by fluorescence quantitative PCR 24 hours after treatment with 20 ug/ml, 30 ug/ml Nystatin and 15 mg/ml exogenous cholesterol and 5 mg/ml M beta CD respectively. The co-localization of the labeled cholera toxin subunits was found, and the co-localization point increased gradually with the increase of time; the H MPV gradually moved toward the nucleus with the increase of CTB. The titer of H MPV decreased by 81%, 90% and 98% respectively with the increase of drug concentration after Mbeta CD treatment; the titer of H MPV decreased by 90% and 98% respectively with the increase of drug concentration after Nystatin treatment. When the concentration of cholesterol reached 100 ug/ml, the infection of H MPV was significantly increased, and the titer of H MPV was 4 times as high as that of the drug treatment group. First, CTB was used to label lipid rafts, and CTB was used to observe the location relationship between lipid rafts and H MPV at different time points. Then, the effect of lipid raft destruction on the infection of H MPV was detected by using two drug-treated cells, M-beta-CD and Nystatin. Finally, the possibility of adding exogenous cholesterol was detected by exogenous cholesterol salvage test. In order to restore h MPV infection, these experiments confirmed that lipid rafts were involved in the process of human PPV endocytosis.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2234574