【摘要】：目的:Cyr61(也稱為CCN1或富含半胱氨酸蛋白61)是一種細胞外信號轉導分子,是CNN蛋白家族中的一員,該蛋白由4個不同結構域構成,這些結構域在不同的微環(huán)境下表現(xiàn)出不同的生物學功能,Cyr61蛋白在細胞分化、血管生成、細胞粘附、細胞凋亡等生物學進程中起重要調控作用。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種來源于中胚層,具有多向分化潛能的成體干細胞,在間充質干細胞向脂肪細胞分化和成骨細胞分化兩個進程中存在著此消彼長的生物學現(xiàn)象。有研究表明,Cyr61在調控成骨細胞分化的過程中起到了非常重要的作用,而Cyr61在脂肪細胞分化過程中的作用及機制卻鮮有報道。本研究以Cyr61為對象探討其對脂肪細胞分化的調節(jié)作用,并闡明其調節(jié)機制。方法:1、間充質細胞系C3H10T1/2轉染Cyr61過表達質粒和敲減Cyr61的siRNA(Cyr61 siRNA),當細胞生長至完全融合時進行成脂誘導培養(yǎng)基處理,利用油紅O染色、qRT-PCR和Western Blotting等技術探究Cyr61對C3H10T1/2細胞成脂分化的影響;2、轉染Cyr61 siRNA到間充質細胞C3H10T1/2,18 h后更換為含有Wnt3a蛋白的新鮮DMEM完全培養(yǎng)基,轉染48小時后,通過細胞免疫熒光實驗檢測β-連環(huán)蛋白(β-catenin)進入細胞核的情況;提取C3H10T1/2細胞核蛋白運用Western blotting檢測細胞核內β-catenin和T細胞因子(T cell factor,TCF)-4蛋白水平。由此來確定Cyr61對經典Wnt通路的作用;3、轉染Cyr61 siRNA到間充質細胞C3H10T1/2,提取細胞總蛋白。運用Western blotting檢測細胞內mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)信號通路活性的標志蛋白雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和S6K1蛋白(ribosomal protein S6 kinase,polypeptide 1)的磷酸化水平,從而確定Cyr61對mTORC1信號通路的作用;4、C3H10T1/2轉染Cyr61 siRNA后,到細胞生長至完全融合時加入mTOR蛋白特異性抑制劑雷帕霉素(Rapamycin,RAP),并進行成脂誘導處理。觀察抑制mTORC1信號通路活性是否減弱Cyr61 siRNA對C3H10T1/2細胞成脂分化的影響,探討Cyr61調節(jié)脂肪細胞分化的分子機制。結果:1、轉染Cyr61過表達質粒后,C3H10T1/2細胞成脂分化減弱,過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT增強結合蛋白α(CCAAT enhancer binding proteinα,C/EBPα)、脂肪細胞特異性基因aP2(Adipocyte fatty acid-binding Protein 2)和脂肪酶(Adipsin)的表達均下調。轉染Cyr61 siRNA敲減Cyr61水平后,C3H10T1/2細胞成脂分化增強,成脂因子表達水平升高。以上結果表明Cyr61抑制C3H10T1/2細胞向脂肪細胞分化的進程。2、細胞免疫熒光實驗結果表明,在C3H10T1/2細胞中Cyr61 siRNA能夠抑制β-catenin進入細胞核;Western blotting結果表明核內β-catenin和TCF-4水平下降,表明Cyr61可以激活經典Wnt信號通路。3、Cyr61 siRNA能夠提高mTOR蛋白和S6K1蛋白的磷酸化水平,表明Cyr61能夠抑制mTORC1信號通路的活性。4、轉染Cyr61 siRNA后進行成脂誘導,與對照組比較,雷帕霉素處理后mTOR蛋白和S6K1蛋白的磷酸化水平下降,Cyr61 siRNA促進成脂分化和成脂特異性因子表達的作用因雷帕霉素處理而減弱,表明Cyr61 siRNA通過激活mTORC1通路而促進成脂分化。這些結果提示Cyr61可以通過抑制mTORC1信號通路的活性進而抑制脂肪細胞的分化過程。結論:1、Cyr61抑制C3H10T1/2細胞向脂肪細胞分化;2、Cyr61能夠激活Wnt/β-catenin信號通路,同時抑制mTORC1信號通路的活性,進而調控C3H10T1/2細胞向脂肪細胞分化。
[Abstract]:OBJECTIVE: Cyr61 (also known as CCN1 or cysteine-rich protein 61) is an extracellular signal transduction molecule and a member of the CNN protein family. The protein consists of four different domains. These domains display different biological functions in different microenvironments. Cyr61 protein is involved in cell differentiation, angiogenesis, cell adhesion and cell death. Mesenchymal stem cells (MSCs) are mesenchymal stem cells derived from mesoderm and have the potential of multi-directional differentiation. There are two biological phenomena in the process of mesenchymal stem cells differentiating into adipocytes and osteoblasts. Cyr61 plays a very important role in the regulation of osteoblast differentiation, but the role and mechanism of Cyr61 in adipocyte differentiation have rarely been reported. Cyr61 was used as the object of this study to investigate its regulatory effect on adipocyte differentiation and clarify its regulatory mechanism. Methods: 1. Mesenchymal cell line C3H10T1/2 transfected Cyr61 overexpression. Cyr61 siRNA was transfected into C3H10T1/2 mesenchymal cells and transformed into C3H10T1/2 cells containing Wnt3a protein after 18 hours. Fresh DMEM complete medium was transfected for 48 hours, and the entry of beta-catenin into the nucleus was detected by immunofluorescence assay. The nucleoprotein of C3H10T1/2 cells was extracted and the levels of beta-catenin and T cell factor (TCF) -4 in the nucleus were detected by Western blotting. 3. Transfection of Cyr61 siRNA into mesenchymal cells C3H10T1/2 to extract total protein. Western blotting was used to detect the activity of mammalian target of rapamycin complex 1 (mTOR) and S6K1 (ribosomal protein S6 kinase, p The phosphorylation level of olypeptide 1 was determined to determine the role of Cyr61 in the mTORC1 signaling pathway; 4, C3H10T1/2 was transfected with Cyr61 siRNA, and then rapamycin (RAP), a mTOR protein-specific inhibitor, was added to the cell growth to complete fusion, and lipid induction was carried out. Results: 1. After transfection of Cyr61 overexpression plasmid, the adipogenic differentiation of C3H10T1/2 cells was weakened, the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR gamma) and CCATT enhancer binding protein alpha (CCAAT enhancer bind) were enhanced. The expression of ing protein alpha, C/EBPalpha, adipocyte-specific gene aP2 (Adipocyte fatty acid-binding protein 2) and lipase (Adipsin) were down-regulated. After Cyr61 siRNA knockdown Cyr61, the adipogenic differentiation of C3H10T1/2 cells was enhanced and the expression of adipokines was increased. These results indicated that Cyr61 inhibited C3H10T1/2 cells to adipocyte. Cyr61 siRNA inhibited the entry of beta-catenin into the nucleus of C3H10T1/2 cells. Western blotting showed that the levels of beta-catenin and TCF-4 in the nucleus decreased, suggesting that Cyr61 could activate the classical Wnt signaling pathway. 3. Cyr61 siRNA could increase the phosphorylation levels of mTOR and S6K1 proteins. Cyr61 could inhibit the activity of mTORC1 signaling pathway. 4. Cyr61 siRNA was transfected and induced to adipogenic. Compared with the control group, the phosphorylation level of mTOR protein and S6K1 protein decreased after rapamycin treatment, and the effect of Cyr61 siRNA on adipogenic differentiation and adipogenic specific factor expression was weakened after rapamycin treatment. These results suggest that Cyr61 can inhibit adipocyte differentiation by inhibiting the activity of mTORC1 signaling pathway. Conclusion: 1. Cyr61 inhibits the differentiation of C3H10T1/2 cells into adipocytes; 2. Cyr61 can activate Wnt/beta-catenin signaling pathway and inhibit the activity of mTORC1 signaling pathway. It regulates the differentiation of C3H10T1/2 cells into adipocytes.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R329.2

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